3.4: Вектори прокаріотичної експресії

$\newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} }$

$\newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}}$

$\newcommand{\id}{\mathrm{id}}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}$

$\newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}$

$\newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}$

$\newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}$

$\newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}$

$\newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}$

$\newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\id}{\mathrm{id}}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}$

$\newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}$

$\newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}$

$\newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}$

$\newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}$

$\newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}$

$\newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

Перший вектор, який ми розглянемо, - це сімейство векторів PuC

Скріншот (301) .png

Малюнок 3.4.1: Вектор PuC

Хоча він зазвичай не використовується для експресії рекомбінантних білків, він має всі необхідні елементи вектора експресії:

Походження реплікації. Сімейство векторів PuC є високими копіями векторів. Вони мають походження реплікації Cole1, але видалення регуляторної області реплікації роп.
Маркер резистентності до ліків. Вектори PuC містять ген резистентності до ампіциліну (b -лактамази).
Індуктивний промоутер. Це сімейство векторів містить промотор лаку (P _lac) разом з асоційованою областю оператора лаку (O _lac)

Ці вектори містять кілька інших елементів, які додають корисності вектору:

Ген LaCi. Цей ген кодує білок лак-репресора. Будучи високою копією плазміди, рівень репресора хаст-лаку може бути недостатнім для ефективного пригнічення оператора лаку на плазмідах. Плазміда виробляє лак-репресор для збільшення рівня господаря.
Ген Lacz. Цей генний продукт транскрибується з промотора лаку і виробляє амінотермінальний фрагмент білка b -галактозидази.
Полілінкер (багаторазове клонування сайту). Цей короткий відрізок ДНК розташований трохи нижче за течією від промотора лаку і після перших кількох кодонів гена LaCz. Це короткий відрізок нуклеотидів, який містить різноманітні ділянки рестрикції ендонуклеази.

a -доповнення

Лак-промотор плазміди PuC може бути індукований за допомогою лактозного аналога ізопропілтіол- b -D-галактозиду. («ІПТГ»).

Це призведе до експресії гена LACZ.
Цей ген кодує амінотермінальний фрагмент білка b -галактозидази
Сам по собі цей фрагмент нефункціональний (він не буде гідролізувати лактозу або інші b -галактозиди)

Однак б- галактозидаза - цікавий білок:

Якщо висловити карбокси-термінальний фрагмент білка, він також нефункціональний.
Але, якщо ми об'єднаємо обидва пептидні фрагменти, вони можуть об'єднатися, щоб отримати функціональний білок b -галактозидази.
Це називається -комплементація

Мутація LacZ D M15 у бактерії означає, що її геном зазнав делеції амінотермінальної області гена LaCZ.

Така бактерія має нефункціональний білок b -галактозидази
Якщо цей тип бактерій містить екстра-хромосомний елемент, який виражає пептид LaCZ, він може доповнювати білок LaCZ D M15 для отримання функціонального білка b -галактозидази (a -комплементація)

Галактозид, 5-бром-4-хлор-3-індоіл- b -D-галактозид («X-Gal»), може бути гідролізований b -галактозидазою і виробляє темно-синій колір.

Бактерії LacZ D M15 в присутності лактози (або IPTG) і X-Gal з'являться нормального біло-жовтого кольору.
Ті самі бактерії, які містять вищевказану плазміду PuC, будуть темно-синього кольору, коли IPTG та X-Gal присутні в середовищах (завдяки a -комплементації та функціональному білку b -галактозидази)

Регіон полілінкеру PuC

Полілінкерна область PuC - це короткий відрізок ДНК, який фактично вставляється в ген LaCZ, безпосередньо нижче за течією від початкового кодону:

Скріншот (303) .png

Малюнок 3.4.2: Регіон полілінкеру PuC

Примітка

На наведеній вище діаграмі числа кодонів для дикого типу b -галактозидази наведені в пурпуровому кольорі (в цьому випадку ініціатор метіоніну не присутній на очищеному білку і першим кодоном вважається залишок ACC (треонін)). Кодони з полілайнера (які переривають ген b -галактозидази) наведені чорним кольором.

Різні доступні області plink є кратними 3 нуклеотидам в довжину, тому ген LacZ залишається в кадрі.
Отриманий пептид LacZ'/plink все ще може функціонувати в a-комплементації.

Що станеться з пептидом LacZ, якби ми вставили фрагмент ДНК в область plink?

Введення випадкового шматочка ДНК в область plink призведе до трьох можливих різних кадрів читання після вставки (залежно від кількості нуклеотидів у вставленому фрагменті)
Існує 33% (кожен третій) ймовірність того, що ген LACZ, що знаходиться нижче за течією, буде переведений у правильну рамку читання
Існує також ймовірність того, що навіть якщо кадр читання є правильним, введення великого пептиду на початку білка LaCZ запобіжить -комплементації.
Тому більшу частину часу фрагмент ДНК, вставлений в область plink, скасує функцію b -галактозидази
Таким чином, вставки ДНК в області plink можуть бути ідентифіковані шляхом вирощування бактерій-господаря на середовищах, що містять IPTG та X-gal, і шукаючи біло-жовті колонії (з застереженням, що деякі сині колонії насправді можуть містити вставку)

ДНК-кодування для цікавого гена може бути вставлено в область plink в кадр з кадром читання LACZ.

Білок, закодований цим геном, може бути експресований індукцією за допомогою IPTG (тобто з використанням P _lac)
Експресований білок матиме в якості амінотермінальної послідовності перші кілька амінокислот гена b -галактозидази (при відсутності будь-яких інших маніпуляцій/мутагенезу). Це також відомий як (короткий) злитий білок.
Хоча промотор лаку вважається відносно слабким, високе число копій плазміди може призвести до корисного рівня експресії білка, що цікавить

Векторна система PET (Novagen, Inc.)

Вектор PET виглядає наступним чином:

Скріншот (306) .png

Малюнок 3.4.3: Вектор ПЕТ

Вона має такі важливі елементи:

Маркер стійкості до ампіциліну
Походження реплікації Cole1
f1 походження реплікації (дозволяє виробляти одножильний вектор при спільному зараженні з M13 хелпер-фагом)
Ген LaCi (білок лак-репресор)
Промотор транскрипції T7 (специфічний для РНК-полімерази фага Т7)
Лак оператора регіону 3' до промоутера T7
багаторазовий сайт клонування (область полілінкера) нижче за течією промоутера T7

Вектор PET трохи відрізняється від вектора PuC: PuC використовує промоутер лаку, а PET використовує промоутер від фага T7

Промотор фага Т7 сильніше, ніж промоутер лаку
РНК-полімераза Phage T7 спеціально розпізнає область промоутера T7 і не буде ефективно транскрибувати від інших промоутерів
Промотор T7 не буде ефективно транскрибуватися РНК-полімеразою E. coli

Звідки прийде РНК-полімераза фага Т7?

Система PET включає в себе не тільки вектор експресії, але і генетично інженерні бактерії-господаря. Бактеріями господаря для вектора PET, як правило, є штам E. coli BL (DE3)

Цей штам інтегрував у свою хромосому ген РНК-полімерази Т7.
РНК-полімераза Т7 в геному господаря побудована таким чином, що вона знаходиться під контролем лак-промотора і оператора
Таким чином, індукція аналогом лактози IPTG змушує господаря виробляти РНК-полімеразу Т7
Геном господаря кишкової палички також несе ген LaCi (репресор)

Скріншот (307) .png

Малюнок 3.4.4: Хромосома E.coli BL (DE3)

Таким чином, індукція IPTG призводить до:

Депресія гена T7 RNA Pol на хромосомі господаря з подальшою продукцією цієї полімерази
Депресія гена-мішеня за відсутності регуляції O
Транскрипція гена-мішені T7 РНК Pol

Таким чином, система поєднує сильний промоутер з жорстким регулюванням (тобто вкрай низьким рівнем вираження в репресованому стані)

Сам вектор PET доступний з декількома різними послідовностями полілінкерів. Вони містять однакові сайти обмежень, але відрізняються фреймом читання, що веде в область PLink:

Скріншот (308) .png

Малюнок 3.4.5: Послідовності полілінкерів

Сайт ggatcc (BamH I обмеження ендонуклеази сайт) є першим сайтом обмеження в полілінкері.
Таким чином, область полілінкера доступна в трьох різних можливих кадрах читання
Таким чином, цікавий ген може бути клонований, щоб бути в кадрі з транскрибованою областю нижче за течією від промотора T7. Знову ж таки, як і вектор PuC, експресований білок буде злитим білком (з 12-13 амінокислотами на амінотермінальному кінці поліпептиду)

Векторна система PtrChis (Invitrogen, Inc.)

Вектор ptrChis виглядає наступним чином:

Скріншот (309) .png

Малюнок 3.4.6: Вектор ПТХК

Важливими елементами є:

Маркер стійкості до ампіциліну
Походження реплікації Cole1
LaCi ^q ген. Це мутація лакового репресора, яка регулюється (виробляє більше лак-репресора, ніж зазвичай)
Промоутер Trc. Це гібрид промоутерів lac і trp, який є сильнішим промоутером в порівнянні з промоутером лаку.
Область оператора лаку нижче за течією P _trc. Це дозволяє регулювати IPTG.
Початкова розтяжка залишків гістидину 6 в амінотермінальній області перекладеного білка, також відомого як область "його тега".
Послідовність розпізнавання розщеплення ентерокінази (EK) (asp asp asp asp lys, з розщепленням після залишку lys)
Полілінкерна область нижче за течією від сайту EK

Призначення тега «Його»

Залишки гістидину можуть координуватися з утворенням місця зв'язування металу (Ni ²⁺) в білку.
Розтяжка з шести Його залишків утворює таке місце зв'язування.
Білки з тегом Гіса мають спорідненість до хелатних смол металів, і ця характеристика може бути використана для вибіркового очищення таких білків.

Призначення місця розщеплення ЕК

Хоча тег His може дозволити швидке та селективне очищення клонованого білка, наявність цих його залишків може перешкоджати нормальній роботі білка
Тег His може бути відщеплений від білка шляхом введення певної послідовності розпізнавання ендопептидази
Послідовність «asp asp asp asp lys» розпізнається і розщеплюється ентерокіназою. Ця послідовність не поширена, і сумнівно, що цікавить білок містить ще одну таку послідовність.

Скріншот (310) .png

Малюнок 3.4.7: Розщеплення ентерокінази

Його теги/EK сайти, як правило, вводяться в аміно кінцевих білків, але можуть бути введені і на карбоксильному терміналі, а також

Вираз хости

Однією з важливих характеристик експресії господарів (бактерій) є те, що вони дозволяють накопичуватися вираженому білку.

Деякі виражені білки можуть складатися неправильно. Хоча вони можуть бути перегорнуті пізніше, щоб отримати функціональний білок, неправильно складені білки можуть швидко протеолізуватися в бактерії-господаря
Протеази господаря можуть вибірково розщеплювати попередники експресованих білків для отримання зрілих активних форм, що може бути небажаним.
OMPT і довгі гени кодують для протеаз, які можуть деградувати експресовані білки.
Дві поширені мутації кишкової палички для усунення дії протеаз господаря включають штами ^omPT ^- і lon.
Штам кишкової палички BL (DE3) є одночасно комПТ ^- і лонг ^-