Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

3.4: Вектори прокаріотичної експресії

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    7458

    • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

    Перший вектор, який ми розглянемо, - це сімейство векторів PuC

    Скріншот (301) .png

    Малюнок 3.4.1: Вектор PuC

    Хоча він зазвичай не використовується для експресії рекомбінантних білків, він має всі необхідні елементи вектора експресії:

    1. Походження реплікації. Сімейство векторів PuC є високими копіями векторів. Вони мають походження реплікації Cole1, але видалення регуляторної області реплікації роп.
    2. Маркер резистентності до ліків. Вектори PuC містять ген резистентності до ампіциліну (b -лактамази).
    3. Індуктивний промоутер. Це сімейство векторів містить промотор лаку (P lac) разом з асоційованою областю оператора лаку (O lac)

    Ці вектори містять кілька інших елементів, які додають корисності вектору:

    1. Ген LaCi. Цей ген кодує білок лак-репресора. Будучи високою копією плазміди, рівень репресора хаст-лаку може бути недостатнім для ефективного пригнічення оператора лаку на плазмідах. Плазміда виробляє лак-репресор для збільшення рівня господаря.
    2. Ген Lacz. Цей генний продукт транскрибується з промотора лаку і виробляє амінотермінальний фрагмент білка b -галактозидази.
    3. Полілінкер (багаторазове клонування сайту). Цей короткий відрізок ДНК розташований трохи нижче за течією від промотора лаку і після перших кількох кодонів гена LaCz. Це короткий відрізок нуклеотидів, який містить різноманітні ділянки рестрикції ендонуклеази.

    a -доповнення

    Лак-промотор плазміди PuC може бути індукований за допомогою лактозного аналога ізопропілтіол- b -D-галактозиду. («ІПТГ»).

    • Це призведе до експресії гена LACZ.
    • Цей ген кодує амінотермінальний фрагмент білка b -галактозидази
    • Сам по собі цей фрагмент нефункціональний (він не буде гідролізувати лактозу або інші b -галактозиди)

    Однак б- галактозидаза - цікавий білок:

    • Якщо висловити карбокси-термінальний фрагмент білка, він також нефункціональний.
    • Але, якщо ми об'єднаємо обидва пептидні фрагменти, вони можуть об'єднатися, щоб отримати функціональний білок b -галактозидази.
    • Це називається -комплементація

    Мутація LacZ D M15 у бактерії означає, що її геном зазнав делеції амінотермінальної області гена LaCZ.

    • Така бактерія має нефункціональний білок b -галактозидази
    • Якщо цей тип бактерій містить екстра-хромосомний елемент, який виражає пептид LaCZ, він може доповнювати білок LaCZ D M15 для отримання функціонального білка b -галактозидази (a -комплементація)

    Галактозид, 5-бром-4-хлор-3-індоіл- b -D-галактозид («X-Gal»), може бути гідролізований b -галактозидазою і виробляє темно-синій колір.

    • Бактерії LacZ D M15 в присутності лактози (або IPTG) і X-Gal з'являться нормального біло-жовтого кольору.
    • Ті самі бактерії, які містять вищевказану плазміду PuC, будуть темно-синього кольору, коли IPTG та X-Gal присутні в середовищах (завдяки a -комплементації та функціональному білку b -галактозидази)

    Регіон полілінкеру PuC

    Полілінкерна область PuC - це короткий відрізок ДНК, який фактично вставляється в ген LaCZ, безпосередньо нижче за течією від початкового кодону:

    Скріншот (303) .png

    Малюнок 3.4.2: Регіон полілінкеру PuC

    Примітка

    На наведеній вище діаграмі числа кодонів для дикого типу b -галактозидази наведені в пурпуровому кольорі (в цьому випадку ініціатор метіоніну не присутній на очищеному білку і першим кодоном вважається залишок ACC (треонін)). Кодони з полілайнера (які переривають ген b -галактозидази) наведені чорним кольором.

    • Різні доступні області plink є кратними 3 нуклеотидам в довжину, тому ген LacZ залишається в кадрі.
    • Отриманий пептид LacZ'/plink все ще може функціонувати в a-комплементації.

    Що станеться з пептидом LacZ, якби ми вставили фрагмент ДНК в область plink?

    • Введення випадкового шматочка ДНК в область plink призведе до трьох можливих різних кадрів читання після вставки (залежно від кількості нуклеотидів у вставленому фрагменті)
    • Існує 33% (кожен третій) ймовірність того, що ген LACZ, що знаходиться нижче за течією, буде переведений у правильну рамку читання
    • Існує також ймовірність того, що навіть якщо кадр читання є правильним, введення великого пептиду на початку білка LaCZ запобіжить -комплементації.
    • Тому більшу частину часу фрагмент ДНК, вставлений в область plink, скасує функцію b -галактозидази
    • Таким чином, вставки ДНК в області plink можуть бути ідентифіковані шляхом вирощування бактерій-господаря на середовищах, що містять IPTG та X-gal, і шукаючи біло-жовті колонії (з застереженням, що деякі сині колонії насправді можуть містити вставку)

    ДНК-кодування для цікавого гена може бути вставлено в область plink в кадр з кадром читання LACZ.

    • Білок, закодований цим геном, може бути експресований індукцією за допомогою IPTG (тобто з використанням P lac)
    • Експресований білок матиме в якості амінотермінальної послідовності перші кілька амінокислот гена b -галактозидази (при відсутності будь-яких інших маніпуляцій/мутагенезу). Це також відомий як (короткий) злитий білок.
    • Хоча промотор лаку вважається відносно слабким, високе число копій плазміди може призвести до корисного рівня експресії білка, що цікавить

    Векторна система PET (Novagen, Inc.)

    Вектор PET виглядає наступним чином:

    Скріншот (306) .png

    Малюнок 3.4.3: Вектор ПЕТ

    Вона має такі важливі елементи:

    • Маркер стійкості до ампіциліну
    • Походження реплікації Cole1
    • f1 походження реплікації (дозволяє виробляти одножильний вектор при спільному зараженні з M13 хелпер-фагом)
    • Ген LaCi (білок лак-репресор)
    • Промотор транскрипції T7 (специфічний для РНК-полімерази фага Т7)
    • Лак оператора регіону 3' до промоутера T7
    • багаторазовий сайт клонування (область полілінкера) нижче за течією промоутера T7

    Вектор PET трохи відрізняється від вектора PuC: PuC використовує промоутер лаку, а PET використовує промоутер від фага T7

    • Промотор фага Т7 сильніше, ніж промоутер лаку
    • РНК-полімераза Phage T7 спеціально розпізнає область промоутера T7 і не буде ефективно транскрибувати від інших промоутерів
    • Промотор T7 не буде ефективно транскрибуватися РНК-полімеразою E. coli

    Звідки прийде РНК-полімераза фага Т7?

    Система PET включає в себе не тільки вектор експресії, але і генетично інженерні бактерії-господаря. Бактеріями господаря для вектора PET, як правило, є штам E. coli BL (DE3)

    • Цей штам інтегрував у свою хромосому ген РНК-полімерази Т7.
    • РНК-полімераза Т7 в геному господаря побудована таким чином, що вона знаходиться під контролем лак-промотора і оператора
    • Таким чином, індукція аналогом лактози IPTG змушує господаря виробляти РНК-полімеразу Т7
    • Геном господаря кишкової палички також несе ген LaCi (репресор)

    Скріншот (307) .png

    Малюнок 3.4.4: Хромосома E.coli BL (DE3)

    Таким чином, індукція IPTG призводить до:

    • Депресія гена T7 RNA Pol на хромосомі господаря з подальшою продукцією цієї полімерази
    • Депресія гена-мішеня за відсутності регуляції O
    • Транскрипція гена-мішені T7 РНК Pol

    Таким чином, система поєднує сильний промоутер з жорстким регулюванням (тобто вкрай низьким рівнем вираження в репресованому стані)

    Сам вектор PET доступний з декількома різними послідовностями полілінкерів. Вони містять однакові сайти обмежень, але відрізняються фреймом читання, що веде в область PLink:

    Скріншот (308) .png

    Малюнок 3.4.5: Послідовності полілінкерів

    • Сайт ggatcc (BamH I обмеження ендонуклеази сайт) є першим сайтом обмеження в полілінкері.
    • Таким чином, область полілінкера доступна в трьох різних можливих кадрах читання
    • Таким чином, цікавий ген може бути клонований, щоб бути в кадрі з транскрибованою областю нижче за течією від промотора T7. Знову ж таки, як і вектор PuC, експресований білок буде злитим білком (з 12-13 амінокислотами на амінотермінальному кінці поліпептиду)

    Векторна система PtrChis (Invitrogen, Inc.)

    Вектор ptrChis виглядає наступним чином:

    Скріншот (309) .png

    Малюнок 3.4.6: Вектор ПТХК

    Важливими елементами є:

    • Маркер стійкості до ампіциліну
    • Походження реплікації Cole1
    • LaCi q ген. Це мутація лакового репресора, яка регулюється (виробляє більше лак-репресора, ніж зазвичай)
    • Промоутер Trc. Це гібрид промоутерів lac і trp, який є сильнішим промоутером в порівнянні з промоутером лаку.
    • Область оператора лаку нижче за течією P trc. Це дозволяє регулювати IPTG.
    • Початкова розтяжка залишків гістидину 6 в амінотермінальній області перекладеного білка, також відомого як область "його тега".
    • Послідовність розпізнавання розщеплення ентерокінази (EK) (asp asp asp asp lys, з розщепленням після залишку lys)
    • Полілінкерна область нижче за течією від сайту EK

    Призначення тега «Його»

    • Залишки гістидину можуть координуватися з утворенням місця зв'язування металу (Ni 2+) в білку.
    • Розтяжка з шести Його залишків утворює таке місце зв'язування.
    • Білки з тегом Гіса мають спорідненість до хелатних смол металів, і ця характеристика може бути використана для вибіркового очищення таких білків.

    Призначення місця розщеплення ЕК

    • Хоча тег His може дозволити швидке та селективне очищення клонованого білка, наявність цих його залишків може перешкоджати нормальній роботі білка
    • Тег His може бути відщеплений від білка шляхом введення певної послідовності розпізнавання ендопептидази
    • Послідовність «asp asp asp asp lys» розпізнається і розщеплюється ентерокіназою. Ця послідовність не поширена, і сумнівно, що цікавить білок містить ще одну таку послідовність.

    Скріншот (310) .png

    Малюнок 3.4.7: Розщеплення ентерокінази

    • Його теги/EK сайти, як правило, вводяться в аміно кінцевих білків, але можуть бути введені і на карбоксильному терміналі, а також

    Вираз хости

    Однією з важливих характеристик експресії господарів (бактерій) є те, що вони дозволяють накопичуватися вираженому білку.

    • Деякі виражені білки можуть складатися неправильно. Хоча вони можуть бути перегорнуті пізніше, щоб отримати функціональний білок, неправильно складені білки можуть швидко протеолізуватися в бактерії-господаря
    • Протеази господаря можуть вибірково розщеплювати попередники експресованих білків для отримання зрілих активних форм, що може бути небажаним.
    • OMPT і довгі гени кодують для протеаз, які можуть деградувати експресовані білки.
    • Дві поширені мутації кишкової палички для усунення дії протеаз господаря включають штами omPT - і lon.
    • Штам кишкової палички BL (DE3) є одночасно комПТ - і лонг -