3.3: Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) та клонування продуктів ПЛР

ПЛР - це метод in vitro для ампліфікації області ДНК, яка знаходиться між двома областями відомої послідовності. Ампліфікація ПЛР досягається за рахунок використання олігонуклеотидних праймерів. Це, як правило, короткі, однониткові олігонуклеотиди, які доповнюють зовнішні області відомої послідовності.

Малюнок 3.3.1: Додаткові масляні ігонуклеотидні грунтовки

Олігонуклеотиди служать праймерами для ДНК-полімерази, а денатуровані нитки великого фрагмента ДНК служать шаблоном. Це призводить до синтезу нових ниток ДНК, які доповнюють нитки батьківського шаблону. Ці нові нитки визначили 5' кінці (5' кінці олігонуклеотидних праймерів), тоді як 3' кінці потенційно неоднозначні по довжині.

Малюнок 3.3.2: Синтез нових ниток ДНК

Спрямований синтез олігонуклеотидів дочірніх ниток ДНК може повторюватися, якщо новий дуплекс денатурируется (нагріванням) і додаткові праймери дозволяють відпалити (шляхом охолодження до відповідної температури).

Етапи:

1. Денатурація шаблону
2. Відпал грунтовки
3. Нарощування грунтовки

складають єдиний «цикл» в методиці ампліфікації ПЛР.

Після кожного циклу знову синтезовані нитки ДНК можуть служити шаблонами в наступному циклі.

Малюнок 3.3.3: Продукт реакції подовження як шаблон

Зверніть увагу, що половина знову синтезованих ниток з другого раунду реплікації мають 5' і 3' termini, які визначаються місцем відпалу олігонуклеотидів праймера.

Короткий опис продуктів в кінці кожного циклу ПЛР:

Малюнок 3.3.4: Продукти ПЛР

Загальна кількість кожного з різних типів олігонуклеотидних фрагментів для кожного циклу можна узагальнити наступним чином:

Малюнок 3.3.5: Типи фрагментів для кожного циклу

• Посилення фрагментів відбувається за такою схемою:
  • Завжди є 1x копія кожного з оригінальних шаблонів - ПЛР, як зазначено, ніколи не відтворює шаблон повної довжини
  • Буде 'x копії кожного фрагмента з невизначеною довжиною (де 'n' — кількість циклів). Фрагменти індетермінантної довжини мають один кінець, визначений ПЛР-праймером, а інший - невизначеної довжини.
  • Буде (2 ⁿ - (n + 1)) x копій кожного фрагмента певної довжини (тобто кожного кінця, визначеного двома праймерами ПЛР).
• Наприклад, через 6 циклів у нас буде
  • 1 х копія кожного оригінального шаблону
  • 6 х копій кожного фрагмента невизначеної довжини
  • (64 - (6 + 1)) = 57 х копій кожного фрагмента певної довжини
• У наведеному вище випадку бажаним продуктом ПЛР буде дуплекс фрагмента певної довжини. Питання: скільки буде вироблено?
  • Оригінальні шаблони не обов'язково будуть відпалювати один з одним.
  • Так само шаблони невизначеної довжини не обов'язково відпалюватимуть один з одним
  • Крім того, у міру того, як триває кількість циклів, фрагменти визначеної довжини значно перевершують кількість інших.
  • Тому оригінальний шаблон і фрагменти індетермінантної довжини, швидше за все, збираються гібридизувати з фрагментами певної довжини.
  • Отже, наше очікуване посилення буде (на прикладі ПЛР 6 циклу)

57 - (6 + 1) = 50 х копій кожного фрагмента певної довжини

(тобто 50 х дуплексів певної довжини)

• Таким чином, очікуване посилення виробу бажаної певної довжини щодо вихідної концентрації шаблону (\(x\)) може бути представлено формулою:

\[[(2^n - (n + 1)) - (n + 1)] x\]

або

\[(2^n - 2(n + 1))\]

(Це часто скорочено до простого правила посилення: (2 ⁿ - 2n) х)

Тлумачення цієї формули полягає в тому, що

• Для заданої кількості циклів 'n' складаємо «2 ⁿ x» сумарні можливі дуплекси
• Для заданої кількості циклів будуть дуплекси '2 (n+1) (або 2n в нашому наближенні) x', які формуються або з початкового шаблону, або фрагмента невизначеної довжини разом з фрагментом певної довжини (і представляють небажаний добуток)
• Таким чином, загальна концентрація потрібного продукту (дуплексів з довжиною, визначеною праймерами ПЛР) складе
  (2 ⁿ - 2 (n+1)) x (де x - концентрація вихідного дуплексу)
• Теоретичне значення посилення ніколи не досягається на практиці. Декілька факторів перешкоджають цьому виникненню, включаючи:

1. Конкуренція додаткових дочірніх ниток з праймерами для відпалу (тобто повторний відпал двох дочірніх ниток не призводить до посилення).
2. Втрата активності ферментів внаслідок термічної денатурації, особливо в пізніх циклах
3. Навіть без термічної денатурації кількість ферменту стає граничною через надлишок молярної мішені в більш пізніх циклах (тобто після 25 - 30 циклів занадто багато праймерів потребують розширення)
4. Можливий другий майданчик відпалу грунтовки і непродуктивного грунтування

Примітка

ПЛР була винайдена в 1985 році Карі Муллісом, працюючи в корпорації Cetus десь поблизу Берклі, штат Каліфорнія. Оригінальний метод ПЛР використовував фрагмент ДНК кишкової палички E. coli I. Цей фермент, однак, денатурує при температурах нижче тієї, яка необхідна для денатурації більшості шаблонних дуплексів. Таким чином, після кожного циклу в реакцію доводилося додавати свіжий фермент. Це було досить нудно. На додаток до цієї проблеми з ферментом, зразки довелося переміщати з однієї температурної ванни в іншу, щоб дозволити окремі етапи денатурації, відпалу та полімеризації, які вимагали різних температур. Це теж було досить нудно.

Таким чином, два основні досягнення дозволили автоматизувати процес, ці досягнення були:

1. Застосування термостабільних ДНК-полімераз, які протистояли денатурації (інактивації) при високих температурах. Таким чином, початкова аліквота полімерази могла тривати протягом численних циклів протоколу. Першу термостабільну ДНК-полімеразу, яку використовували, виділили з бактерії Thermus aquaticus. Він був ізольований від гарячого джерела в Єллоустонському національному парку, де він жив щасливо (тобто він відтворював свою ДНК) при температурі понад 85° C
2. Розробка температурних ванн, які можуть швидко зміщувати температуру вгору і вниз і в автоматизованому запрограмованому порядку. Вони відомі як термічні циклери або машини ПЛР.

Ці дві розробки дозволили автоматизувати ПЛР. Процес ПЛР охоплюється патентами, що належать компанії Hoffmann-La Roche Inc. (безликий конгломерат, якому можна довіряти).

Параметри термічного циклічного циклу

• Параметри термоциклічного циклу мають вирішальне значення для успішного експерименту з ПЛР. Важливі етапи кожного циклу ПЛР включають:

1. денатурація шаблону
2. відпал грунтовок
3. розширення праймерів

Репрезентативний температурний профіль для кожного циклу може виглядати наступним чином:

Малюнок 3.3.6: Температура для циклу ПЛР

Денатурація шаблону

• Початкову денатурацію шаблону здійснюють при 95-100 °С.
  • Суперспіральні плазміди важче розплавляються і можуть вимагати кип'ятіння протягом декількох хвилин, або можуть бути спочатку денатуровані за допомогою основи (NaOH з подальшою нейтралізацією рН).
  • Денатурацію під час ПЛР-експерименту (тобто другого циклу далі) зазвичай проводять при температурах 92-95° C (зазвичай дослідним шляхом).

Температура відпалу грунтовки

• Температура відпалу грунтовки є важливим параметром успіху експерименту з ПЛР.
• Температура відпалу характерна для кожного олігонуклеотиду:
  • це функція довжини та базового складу ґрунтовки, а також іонної сили реакційного буфера.
  • Оцінки температури відпалу можуть бути розраховані декількома різними способами.
  • Ці розрахункові температури відпалу є відправною точкою для експерименту з ПЛР, але ідеальні температури відпалу визначаються емпіричним шляхом.

Нарощування грунтовки

• Нарощування праймера зазвичай проводиться при температурі 72° C або оптимальній температурі ДНК-полімерази.
• Тривалість етапів розширення праймера може бути збільшена, якщо область ДНК, що підлягає ампліфікації, є довгою, однак для більшості експериментів з ПЛР достатньо часу продовження 2 хвилин, щоб отримати повне розширення.

Кількість циклів

• Кількість циклів зазвичай становить від 25 до 35.
  • Більше циклів означає більший вихід продукту.
  • Однак зі збільшенням кількості циклів більша ймовірність генерації різних артефактів (наприклад, помилкових продуктів).
  • Незвично знайти процедури, які мають більше 40 циклів.

Вибір полімераз для ПЛР

• Одним із важливих досягнень, що дозволили розробити ПЛР, стала доступність термостабільних полімераз.
• Це дозволило спочатку доданому ферменту витримати температурні цикли наближаються до 100° C.

Термостабільні ДНК-полімерази та їх джерела

ДНК-полімераза	Природні або рекомбінантні	Джерело
Taq	Природні	Термус водний
Амплітак®	рекомбінантний	Т. Акватик
Амплітака (фрагмент Штофеля)®	рекомбінантний	Т. Акватик
Гідромасажна ванна™	Природні	Термус флавіс
Піростаза™	Природні	Т. флавіс
Вент™	рекомбінантний	Термокок літоральний
Глибока вентиляція™	рекомбінантний	Пірокок GB-D
Tth	рекомбінантний	Термофільний термофільний
ПФУ	Природні	Пірокок фуріозний
Ультма™	рекомбінантний	Термотога морська

• Властивості ДНК-полімераз, що використовуються в ПЛР

	Taq/Амплітак®	Фрагмент Stoffel	Вент™	Глибока вентиляція™	ПФУ	Tth	Ультма™
95° C період напіврозпаду	40 хв	80 хв	400 хв	1380 хв	> 120 хв	20 хв	>50 хв
5'3' екзо	+					+
3'5' екзо			+	+	+		+
Швидкість розширення (нт/сек)	75	>50	>80	?	60	>33	?
RT діяльність	Слабкий	Слабкий	?	?	?	Так	?
отримані кінці	3' A	3' A	> 95% тупий	> 95% тупий	тупий	3' A	тупий
зміщення пасма			+	+
М.В. (кДа)	94	61	?	?	92	94	70

Буфери та MgCl ₂ в реакціях ПЛР

Типовий буфер реакції для ПЛР буде приблизно таким:

• Трис 10 мм, рН 8,3
• 50 мм Ккл
• 1,5 Мм мгКл ₂
• 0,01% желатин
• Концентрація MgCl ₂ в кінцевій реакційній суміші зазвичай становить від 0,5 до 5,0 мМ, а оптимальна концентрація визначається емпіричним шляхом (зазвичай між 1,0 - 1,5 мМ). Mg ²⁺ іони:
  • утворюють розчинний комплекс з dNtP, що має важливе значення для включення dNTP
  • стимулюють активність полімерази
  • підвищення Tm (температури плавлення) взаємодії грунтовки/шаблону (тобто служить для стабілізації дуплексної взаємодії

Як правило,

• низький Mg ²⁺ призводить до низької врожайності (або відсутності врожайності) і
• високий Mg ²⁺ призводить до накопичення неспецифічних продуктів (неправильна праймінг).

Грунтовки

Дизайн грунтовки

• Як правило, грунтовки використовуються 20 - 30 метрів в довжину. Це забезпечує практичні температури відпалу (високотемпературного режиму, де найбільш активна термостабільна полімераза).
• Грунтовки повинні уникати розтягувань послідовностей поліоснови (наприклад, полі dG) або повторюваних мотивів - вони можуть гібридизуватися з невідповідним регістром на шаблоні.
• Слід уникати перевернутих повторних послідовностей, щоб запобігти утворенню вторинної структури в грунтовці, що запобігає гібридизації шаблону
• Слід уникати послідовностей, що доповнюють інші праймери, що використовуються в ПЛР, щоб запобігти гібридизації між праймерами (особливо важливо для 3-футового кінця праймера)
• Якщо можливо, 3' кінець грунтовки повинен бути багатим основами G, C для посилення відпалу кінця, який буде продовжений
• Відстань між праймерами має бути менше 10 Кб в довжину. Як правило, істотне зниження врожайності спостерігається, коли грунтовки відходять один від одного за межі ~3 Кб.

Температура плавлення (Tm) праймерів

• Tm гібридизації грунтовки може бути розрахована за різними формулами. Найбільш часто використовувана формула:

\[Tm = [(number of A+T residues) \times 2 °C] + [(number of G+C residues) x 4 °C]\]

• Ця формула була визначена спочатку з аналізів гібридизації олігонуклеотидів, які проводилися в 1 M NaCl, і, здається, є точною в умовах нижчої солі лише для праймерів довжиною менше близько 20 нуклеотидів.
• Загальною мудрістю є те, що Tm більше на 3-5° C нижче, ніж значення, розраховане за цією формулою.

\[Tms = 81.5 + 16.6(\log_{10}[J+]) + 0.41(\%G+C) - (600/l)\]

• Де [J ⁺] = молярна концентрація одновалентних катіонів (наприклад, Na ⁺ з NaCl), а l = довжина олігонуклеотиду. (% G+C) є фактичним відсотковим значенням, а не дробовим представленням (тобто значення, яке потрібно вставити для праймера, який мав 90% вмісту G+C, буде «90", а не «0.90").
• Ця формула, як повідомляється, корисна для грунтовки довжиною від 14 до 70 основ.

\[Tmp = 22 + 1.46([2 \times (G+C)] + (A+T))\]

• Ця формула, як повідомляється, корисна для грунтовок довжиною 20-35 основ.
• Розрахункова температура відпалу - це лише еталонна температура, з якої можна починати експерименти.
  • Фактична температура відпалу може бути на 3-12 °С вище розрахункової Tm.
  • Фактичний температурний режим відпалу слід визначати дослідним шляхом.
  • Слід використовувати найвищу температуру відпалу, яка дає найкращий продукт ПЛР.
• Приклади розрахунків T _m, T _{m s і T m} p (0,05 M K ⁺)

	Г	A	Т	C	Т м	Т м с	Т м п
15 мер	3	5	2	5	46	42	56
20 мер	6	5	4	5	62	52	67
30 мер	8	6	8	8	92	62	89

Розрахунок концентрації грунтовки

• Молярну концентрацію праймера можна розрахувати виходячи з поглинання праймера при 260 нм (А ₂₆₀) і молярного коефіцієнта екстинкції для праймера на цій довжині хвилі.
• Молярний коефіцієнт екстинкції для праймера можна обчислити, знаючи послідовність грунтовки, а потім підсумовуючи значення молярного зникнення для окремих основ, що входять до складу праймера.
• Окремі підстави мають наступні молярні коефіцієнти екстинкції при 260 нм:
  • 1,0 молярний розчин dT має значення 8400 одиниць поглинання при 260 нм.
  • 1,0 молярний розчин dA має значення 15 200 одиниць поглинання при 260 нм.
  • 1,0 молярний розчин dG має значення 12,010 одиниць поглинання при 260 нм.
  • 1,0 молярний розчин постійного струму має значення 7050 одиниць поглинання при 260 нм.
• Наприклад, праймер 5' TAGC 3' мав би молярний коефіцієнт екстинкції 42 660 при 260 нм. Так само 10 мікромолярний розчин цього праймера дасть поглинання 0,427 при 260 нм.

Клонування продуктів ПЛР

Введення обмежень сайтів

• Можна ввести послідовності місць обмеження в продукти ПЛР, включивши ці послідовності в 5' кінець праймера (ів) ПЛР.

Малюнок 3.3.7: Введення послідовності сайту обмеження

• Коротка послідовність місць обмеження на 5' кінці ПЦР-праймера не буде гібридизуватися, але до тих пір, поки 3' гібридизуюча область досить довга (тобто її Tm досить висока; ~ 20 більше) праймер буде спеціально зв'язуватися з відповідним місцем.
• Таким чином, продукт ПЛР матиме додаткову послідовність ДНК на 5-футовому кінці, яка буде містити місце обмеження ендонуклеази.
• Подібну або іншу послідовність місць обмеження можна додати за допомогою іншого ПЦР-праймера.
• Якщо інший праймер має іншу послідовність обмежень, то фрагмент ПЛР може бути вставлений спрямованим залежним способом у плазміді господаря.

До потенційних проблем з цим методом можна віднести:

• Немає простого способу запобігти різанню внутрішніх ділянок, що містять подібні послідовності обмежень, коли кінець продукту ПЛР розрізається.
• Рестрикційні послідовності є зворотними повторними послідовностями, тому існує потенціал для асоціації димерів праймера та результуючого непродуктивного відпалу

Генерація половини сайтів

• Цей спосіб схожий на спосіб введення сайтів обмежень, описаний вище.
• Основна відмінність полягає в тому, що замість праймера, що містить всю послідовність місця обмеження (скажімо, шість нуклеотидів шести різака) він буде містити лише останні три (а інший праймер ПЛР буде містити комплементарну послідовність для перших трьох).

Малюнок 3.3.8: Половина сайтів

Перевагами цього методу є:

• Зазвичай місця внутрішнього обмеження розщеплюються з набагато більшою ефективністю (тобто деякі ділянки, якщо розташовані на кінцях лінійної ДНК, взагалі ніколи не ріжуться добре)
• Немає необхідності очищати гелем фрагменти компоновки після травлення.
• ДНК може бути метильованою (половини ділянок не буде). Після конкатенації компонувальники будуть скорочені, але внутрішні обмеження сайтів не будуть.

• Недоліком є те, що один і той же ділянку обмеження вбудований в обидва кінці, тому фрагмент ПЛР не може бути перев'язаний у головний вектор залежно від орієнтації способом.
• Крім того, в цьому методі 3' Звис не можна допускати.

Тупий кінець лігування

• Як зазначалося раніше, деякі термостабільні ДНК-полімерази додають один залишок dA на 3' кінець продукту ПЛР.
• Існує три варіанти, які слід зробити при спробі субклонування без використання додаткових сайтів обмежень всередині праймерів:
  • Використовуйте ДНК-полімеразу, яка залишає 3' нитку тупим (наприклад, Vent) і зробити тупий кінець лігування (тобто вектор господаря був відкритий з тупим різанням обмеження ендонуклеази)
  • «Виправте» 3' звис, пережовуючи назад з Pol I, DnTp.
  • Використовуйте звис 3' A для відпалювання та лігування до вектора «T» - вектора, який має єдиний звис dT на його 3' кінцях.
• Вектори «T» можуть бути зроблені шляхом відкриття вектора, через тупе різання обмеження ендонуклеази і лігування в конкретному компонувальнику.
• Компонувальник містить рестрикційну послідовність для рестрикційної ендонуклеази, яка розпізнає перерваний паліндром та розрізи у внутрішній області з єдиним 3' звисом.
• Компонувальник буде містити дві копії послідовності розпізнавання обмежень, перша з послідовністю в перерваному паліндромі, яка залишає 3' T звис, а друга з послідовністю в перерваному паліндромі, який залишає ще один 3' T звис.
• Це може здатися заплутаним, тому ось приклад того, як зробити вектор T:

І я обмеження ендонуклеази:

           |
G A C N N N N N G T C 
C T G N N N N N C A G
         |

І я виріжу цю послідовність, щоб зробити:

G A C N N N                 N N G T C 
C T G N N                 N N N C A G

Ми могли б розробити олігонуклеотид з двома обмежувальними послідовностями Ahd I, з дещо різними послідовностями в перериваній області паліндрому, щоб дати:

           |                     |
G A C N N T N N G T C G A C N N A N N G T C
C T G N N A N N C A G C T G N N T N N C A G
         |                     |

Якби це було вставлено в вектор, а вектор потім був вирізаний з Ahd I, він мав би наступну послідовність на кінцях лінеаризованого вектора:

-G A C N N T                       N N G T C-
-C T G N N                       T N N C A G-

Іншими словами, звис 3' 'T' на обох кінцях вектора. Таким чином, продукт ПЛР з нависами 3' A може бути вставлений у такий вектор 'T'

Додавання промоутерів, сайтів прив'язки рибосом, запуску кодонів та зупинки кодонів

• Можливість додавати унікальні послідовності до 5-футових кінців праймерів ПЛР дозволяє безпосередньо включати короткі керуючі елементи.
• Вони можуть включати початковий кодон або стоп-кодон (3 основи), промотор (~ 30 нуклеотидна область) або сайт зв'язування рибосом (~ 8 основ).

Малюнок 3.3.9: Вставка промотора/рибосоми/місця зв'язування/стартового кодону/стоп-кодону

Мутагенез ПЛР

Злиття генів

• Цей метод корисний для приєднання областей, що перекриваються великого гена, або для побудови химерних генів.

Малюнок 3.3.10: Злиття генів

Створення делецій всередині гена

• Дуже схожа методологія може бути використана всередині одного гена для вироблення мутантного гена, що містить специфічну делецію:

Малюнок 3.3.11: Вилучення

• Якщо ген міститься в циркулярній ДНК (тобто плазміді), делеції можуть бути побудовані в одній реакції ПЛР з одним набором праймерів (цей тип методології також відомий як «зворотна» ПЛР).

Малюнок 3.3.12: Зворотна ПЛР

Генерація точкових мутацій (ів) - тобто мутацій заміщення бази

• Генерація базових замін може протікати за аналогічним маршрутом, як і при мутаціях видалення.
• Однак в цьому випадку праймери мутагенні - виникне невідповідність, або невідповідність, між праймером і цільової послідовностями.
• Мутагенний оліго матиме нижчий, ніж очікувалося, Tm через цю невідповідність (и).

Малюнок 3.3.13: Точкова мутація

Введення базових заміщень за допомогою асиметричної ПЛР:

Малюнок 3.3.14: Заміна асиметричною ПЛР

Введення мутагенезу

• Короткі вставки (~ 1-6 базових пар) можуть бути включені безпосередньо в праймер ПЛР, або всередині, або на 5-футовому кінці.
• Якщо шаблонна ДНК лінійна і потрібне місце введення не знаходиться в кінці шаблону, то весь ген (плюс введення) може бути отриманий за допомогою асиметричної ПЛР або перекривається ПЛР (тобто показано вище).

Малюнок 3.3.15: Мутагенез вставки

• Великі вставки можуть бути виконані за допомогою шаблону (бажаної вставки) для ПЛР з праймерами, що мають 5' послідовності, які доповнюють область введення в потрібний ген:

Малюнок 3.3.16: Велика вставка

«Випадковий» мутагенез з ПЛР

• Протокол ПЛР можна модифікувати таким чином, щоб вводити мутації у випадкових положеннях в цільовій ДНК.
• Принцип мутагенезу полягає в дезінтеграції баз на «випадкових» позиціях.
• Наприклад, дезінкорпорація полімеразою Taq може бути досягнута шляхом додавання Mn ²⁺ до реакційного буфера та зменшення концентрації одного з чотирьох dNtP.
  • На сайтах в шаблоні, де повинна бути закладена зменшена база, буде підвищена ймовірність дезінкорпорації.
  • Таким чином, вибір бази зі зменшеною концентрацією визначає ділянки в шаблоні, які потенційно будуть мутовані.
  • Дезінкорпована база більш-менш випадкова.
• Ідеальна концентрація Mn ²⁺ для додавання коливається в межах від 0,1 до 0,5 мМ і визначається емпіричним шляхом. Відносні концентрації основ становить 1 мМ для кожної основи, за винятком відновленої основи, яка, як правило, присутня при співвідношенні 1:5 або 1:10 (тобто від 0,2 до 0,1 мМ).