3.2: Аналіз послідовності ДНК

Секвенування ДНК найчастіше здійснюється за допомогою процедури, яку називають однією з наступних назв:

1. Секвенування Сангера
2. Послідовність ді-детоксикації
3. Послідовність припинення ланцюга

• Кожен з них відноситься до одного і того ж методу:
  • використання ді-деокси-основи включення в реакцію полімеризації
  • призводить до припинення розширення грунтовки (метод піонером Фред Сангер, тепер у відставці і щасливо шпаклює в своєму саду).

Основний метод передбачає:

1. відпал грунтовки 5' до області ДНК, яку ми хотіли б послідовно.
2. Праймер розширюється традиційним способом (тобто за допомогою ДНК-полімерази та чотирьох dNTp).
3. Однак невелика концентрація дідеокси-підстав включається в реакційну суміш.
   • Зазвичай це досягається шляхом наявності чотирьох окремих реакцій, в які додається одна з DdNtP.
   • Таким чином, одна трубка буде містити праймер, шаблон, ДНК-полімеразу, чотири dNTp і DDatP, інша трубка буде мати те ж саме, але з DdTTP замість DDatP, і так далі для DdCTP і DdGtp.
4. Під час реакції нормальні dnTp включаються в зростаючий ланцюг.
   • Однак іноді пул ДНК буде включати базу dd у зростаючий грунт.
   • Коли це станеться, грунтовка не може бути продовжена далі (оскільки основа 3' dd не має наявної 3' гідроксильної групи).
   • Отриманий фрагмент ДНК починається в 5' кінці секвенування грунтовки і закінчується на місці включення dd бази.

Таким чином, в реакційній суміші, що містить dd base ddaTp, вийде ансамбль фрагментів різної довжини, кожен з яких закінчується основою dDA (тобто на всіх позиціях шаблону, де була додаткова «T» база).

Суміш, що містить ddCTP, матиме різну суміш фрагментів - вони міститимуть dDC на 3' кінцях (у позиціях у шаблоні, де були розташовані основи 'G').

Малюнок 3.2.1: Фрагменти ДНК

• Якщо фрагменти з реакційної суміші «А» запускаються на гелі сечовини/акриламіду (зазвичай 6%), фрагменти відокремлюються відповідно до розміру.
• Аналогічно для фрагментів реакції «C», «G» та «T».
  • Якщо чотири різні реакційні суміші виконуються поруч один з одним, розміри фрагментів можна безпосередньо порівняти один з одним.
  • Зверніть увагу, що найкоротший очікуваний фрагмент - це сама грунтовка і чим довше фрагмент, тим далі від грунтовки пішла реакція розширення до припинення.
• Розглянемо випадок, коли шаблон має розтягнення шести основ 'A' поспіль.
  • У реакційній суміші 'T' ми згодом отримаємо шість фрагментів; кожен закінчується на 'T' і відрізняється на одну довжину основи.
  • Жодна з інших реакційних сумішей не буде містити фрагментів між цими довжинами (вони будуть або довшими, або коротшими), оскільки жодна з інших реакційних сумішей не закінчиться в межах цієї області.
  • Таким чином, якщо ми проведемо чотири реакційні суміші пліч-о-пліч і подивимося на фрагменти шаблонів, ми побачимо наступне:

Малюнок 3.2.2: Приклад візерунків фрагментів з 6 А

Тепер розглянемо шаблон, який містить послідовність 3' GATC 5' (зверніть увагу на орієнтацію).

• Коли праймер розширюється в різних реакційних сумішах, він може скорочуватися спочатку на G (включаючи dd 'C'), потім на A (включаючи dd 'T') і так далі.
• Фрагменти, що працюють на гелі, таким чином, виглядатимуть так:

Малюнок 3.2.3: Приклад шаблонів фрагментів з GATC

• Таким чином, проходження по сходах фрагментів на гелі секвенування дозволяє «прочитати» послідовність шаблону.
• Зверніть увагу, однак, що щодо шаблону, коли ми читаємо від нижньої частини гелю до верху, ми читаємо в напрямку від 3 до 5' і читаємо додаткові основи до фактичної послідовності.

Візуалізація фрагментів

• Якщо радіомаркований DatP буде шипами в суміші, він буде включений як «нормальна» база DatP.
  • Однак отриманий фрагмент ДНК буде променевим.
  • Таким чином акриламідний гель може піддаватися впливу рентгенівської плівки і визначення місця розташування фрагментів.
• Останнім часом автоматизовані секвенсори використовували специфічні барвники, які позначаються на дидеокси-основах.
  • Ці барвники можуть бути «прочитані» лазером і, таким чином, може бути ідентифікована специфічна кінцева основа dd для певного фрагмента ДНК.
  • Таким чином, фрагменти можуть зчитувати в міру їх еліту, а не зупиняти гель і оголювати його.
  • Крім того, оскільки кожна база dd може бути однозначно ідентифікована, всі чотири реакції (dDa, dDc, DdG та припинення ланцюга DdT) можуть бути виконані в одній трубці і працювати в одній смузі на гелі секвенування
    • Таким чином, автоматизовані секвенсори можуть читати далі, ніж за допомогою ручних методів.
    • Оскільки для кожного зразка використовується одна смуга (порівняно з чотирма смугами з методом радіоміток), можна проаналізувати набагато більше зразків, а пропускна здатність більша
• Акриламідні гелі, що використовуються для аналізу послідовності, зазвичай мають довжину від 50 см до 100 см.
  • При ручному секвенуванні завантажуються чотири реакційні суміші, і гель запускається приблизно протягом 2 годин, потім зразки перезавантажуються на іншу частину гелю і триває запуск гелю. Третій набір зразків може бути завантажений ще через 2 години.
    • Гель зупиняється після того, як фарбувальний фронт останнього завантаженого зразка щойно досяг дна гелю.
    • Таким чином, короткі фрагменти можуть бути візуалізовані в останньому навантаженні, середні фрагменти в другому навантаженні і довгі фрагменти будуть візуалізовані в першому наборі реакційних сумішей, завантажених.
    • Ручне секвенування може вирішуватися на порядку 400 основ безперервної послідовності. Автоматизовані секвенсори можуть регулярно надавати вдвічі більше інформації.
  • Автоматизовані секвенсори використовують однакові типи скляних пластин
    • Безперервний хід гелю (і ідентифікація барвника) означає, що зазвичай можна прочитати 400-700 основ або більше
    • Автоматичне програмне забезпечення інтерпретує сигнали барвника в послідовність
    • нюанси хімії секвенування та експертні знання можуть бути запрограмовані в програмному забезпеченні для аналізу послідовностей (наприклад, програмне забезпечення може компенсувати «посмішку» гелю)