2.2: Ріст і розмноження бактерій

Last updated
Save as PDF

Page ID: 7570

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Джгутики і моторика

монотрихозні джгутики - бактеріальна клітина має єдиний джгутик
перитріческіе джгутики - бактеріальна клітина має кілька джгутиків, які розташовані в різних місцях на поверхні клітини (наприклад, кишкова паличка)

Рухливість обумовлена наявністю одного або декількох джгутиків.

у перитричних джгутикових бактерій джгутики обертаються незалежно один від одного
- 95% часу джгутики обертаються проти годинникової стрілки
- 5% часу джгутики перемикають напрямки і обертаються за годинниковою стрілкою
- Коли всі джгутики обертаються проти годинникової стрілки, джгутики з'єднуються між собою, і бактерії подорожують по прямій лінії (тобто плаває)
- Коли один джгутик перемикає напрямок, пучок розшаровується, і бактерії перевалюються.
- альтернативне плавання та перекидання призводить до тривимірної випадкової ходьби
хемоаттрактанти і репеленти можуть взаємодіяти з рецепторними білками в оболонці клітини, які, в свою чергу, впливають на швидкість перекидання при русі клітини в заданому напрямку

Зростання і розмноження

Істотні вимоги до зростання включають:

постачання відповідних поживних речовин
джерело енергії
вода
відповідна температура
відповідний рН
відповідні рівні (або відсутність) кисню

поживні речовини

Клітинам потрібен джерело:

вуглець
азоту
фосфорні
сірки
інші слідові матеріали

Хоча дана бактерія зазвичай використовує обмежений спектр сполук, бактерії як група можуть використовувати широкий спектр сполук як поживні речовини:

цукру і вуглеводи
амінокислоти
стерини
спирти
вуглеводні
метан
неорганічні солі
вуглекислий газ

Енергія

Енергія потрібна для

основні хімічні реакції
поглинання поживних речовин
моторика джгутиків

Фототрофні проти хемотрофних бактерій

фототрофний - енергія, отримана від джерела світла
хемотрофний - енергія виходить при переробці хімічних речовин з навколишнього середовища

Вода

80% маси типових бактерій становить вода
Вода потрібна для росту і розмноження
Дессикація (крайня нестача води) переноситься в різному ступені різними бактеріями

Температура

Зростання протікає найбільш швидко при оптимальній температурі росту для конкретної бактерії (і зменшується в міру підвищення або зниження температури від цього оптимального)
Для будь-яких бактерій існує мінімальна і максимальна температура, за межами якої зростання не підтримується

Термофільні бактерії

оптимальна температура росту> 45° C
відбуваються в компостних купах, гарячих джерелах та гідротермальних отворах океанічного дна
Піродикції мають оптимальну температуру росту 105° C

мезофільні бактерії

оптимальні температури росту від 15 до 45° C
живуть у широкому діапазоні проживання
оскільки організм людини становить 37-42° C, патогенні бактерії людини є мезофілами

психрофільні бактерії

оптимально при 15° C або нижче
мінімальна температура 0°C, або менше
максимальна температура 20°C
відбуваються в полярних морях

рН

більшість бактерій оптимально ростуть поблизу нейтрального рН (7,0)
ацидофіли мають оптимальний рН з більш кислим (Thermoplasma acidophilum, що міститься в гарячих джерелах, віддає перевагу рН 0,8-3, і не буде рости при нейтральному рН)
алкалофіли мають оптимальний при більш високих (лужних) діапазонах рН (Exiguobacterium aurantiacum, зустрічається в природних лужних озерах, віддає перевагу рН 8,5-9,5)

Кисень

бактерії, які повинні мати кисень для росту, називаються облігатними аеробами
бактерії, які можуть рости лише за відсутності кисню, називаються облігатними анаеробами (наприклад, навколишнє середовище, яке ізольовано з атмосфери; наприклад, річкова грязь, і всередині кишечника, наприклад)
бактерії, які в нормі ростуть у присутності кисню, але які можуть встигати рости за його відсутності, називаються факульативними анаеробами
навпаки, бактерії, які зазвичай ростуть анаеробно, але яким вдається рости в присутності кисню, називаються факульативними аеробами

неорганічні іони

Всі бактерії потребують низьких концентрацій певних неорганічних іонів для того, щоб функціонувати, наприклад,

залізо для цитохромів (енергетичний обмін), і певні ферменти
магній для стабільності клітинної стінки
марганець і нікель в метаболічних ферментах

високі концентрації зазвичай гальмують ріст (наприклад, сіль використовувалася для консервування свинини, яловичини та тріски)
деякі бактерії, галофіли, ростуть тільки в присутності високих концентрацій певних солей (наприклад, хлориду натрію). Галобактерії ростуть тільки при наявності 3-4 М NaCl. Ця кількість солі необхідна для підтримки структури клітинної стінки та внутрішніх молекулярних збірок (наприклад, рибосом).

Зростання в одній клітині (наприклад, кишкова паличка - грамнегативна паличка)

Цикл подій, в яких клітина росте, і ділиться на дві дочірні клітини, називається клітинним циклом.

«Повільний ріст»

Скріншот (231) .png

Малюнок 2.2.1: Реплікація для повільного зростання

Реплікація починається в певному місці на хромосомі - походження або області «орі».
Під час «повільного зростання» кожна нова дочірня клітина містить рівно одну хромосому, тому що новий виток хромосомної реплікації починається тільки після завершення клітинного ділення

Цикл поділу клітин можна розглядати як лінійну послідовність трьох періодів: I, C і D

С - період, протягом якого відбувається хромосомна реплікація.
D - період, в якому утворюється перегородка, а поділ клітин відбувається в кінці періоду D
I - період між кожною послідовною ініціацією хромосомної реплікації

Для вищевказаного типу повільного зростання зв'язок між цими трьома періодами виглядає наступним чином:

Скріншот (232) .png

Малюнок 2.2.2: Періоди клітинного циклу для повільного росту

Я також відомий як подвоєння часу росту бактерій

«Швидке зростання»

Скріншот (233) .png

Малюнок 2.2.3: Реплікація для швидкого зростання

Новий виток реплікації хромосом починається до того, як відбувається поділ клітин

Скріншот (234) .png

Малюнок 2.2.4: Клітинний цикл для швидкого зростання

Кожна дочірня клітина має еквівалент близько 1 ½ хромосом
У швидко зростаючих клітинам кишкової палички період С становить близько 42 хвилин, а D - близько 25 хвилин.
Максимальний час подвоєння кишкової палички становить близько 20 хвилин

«середовище «: будь-яка тверда або рідина, спеціально підготовлена для росту бактерій
«культура «: рідке або тверде середовище, що містить бактерії, які виросли (або ростуть) в або на цьому середовищі
«інкубація «: процес підтримки тієї чи іншої температури (і/або інших бажаних умов) для росту бактерій
«іннокуляція»: початковий процес додавання клітин до середовища

Зростання на твердому середовищі

Рідкий розчин поживних речовин плюс 1% агар (краща форма желе в Азії. Полісахарид, витягнутий з морських водоростей; на відміну від Western Jello (який є білком, витягнутим з копит великих сільськогосподарських тварин), утворює тверді середовища.

Типовий рецепт твердого середовища (1 літр). Засоби масової інформації тут зазвичай називають «бульйон Лурії», або «LB». Він названий на честь одного з вчених, який його розробив (а не «Доктор Бульйон»).

Дріжджовий екстракт 5 г (нуклеїнові кислоти, кофактори, неорганічні солі, вуглеводи)
Триптичний перетравлювач казеїну (молочний білок) 10г (пептиди і амінокислоти)
NaCl 10 г (примітка: кінцева концентрація, таким чином, 0,17 М, або близька до фізіологічної)
Агар 10г
Вода (довести об'єм до 1,0 л)
Автоклав, перелити в чашку Петрі, дати охолонути

Окрема бактеріальна клітина розділиться і в кінцевому підсумку стане видимою масою клітин, відомої як колонія.

Якщо замість однієї клітини тверде середовище спочатку заселяється великою кількістю клітин, буде видно збіглися зростання або газон бактерій

Скріншот (235) .png

Малюнок 2.2.5: Зростання на твердому середовищі

«Смугасті» тверді медіа-пластини

бактерії можуть бути введені на тверді середовища стерильним переносним інструментом, таким як дротяна петля (ніхромовий дріт), або автоклавна зубочистка, яка була занурена в бактеріальну культуру
така передача містить тисячі окремих бактеріальних клітин
колонії бажано вирощувати з окремих клітин, а не з великої популяції

Це робиться для того, щоб уникнути поглинання деформації потенційними ревертантами дикого типу

«смугастість» - це метод виділення окремих клітин для росту на твердому середовищі з інокуляції, яка спочатку містить тисячі клітин

Скріншот (237) .png

Малюнок 2.2.6: Смуги

Зростання в рідкому середовищі

Без агару
Використовуйте колбу Ерленмейера або ферментер
При необхідності провітрювати, перемішують
потомство буде розподілено по всьому середовищу (дифузія або локомоція)
зі збільшенням щільності клітин середовище стає каламутним
кількість клітинок, побудованих у порівнянні з часом, дасть криву зростання

Малюнок 2.2.7: Крива зростання в рідкому середовищі

«Лаг-фаза» після щеплення клітини приживаються до нового середовища (темп, поживні речовини і т.д.)
Клітини «лог-фази» адаптувалися і діляться з постійною швидкістю (тобто максимальною для виду при заданих умовах температури, рН, поживних речовин, кисню і т.д.)
«стаціонарна фаза» зростання клітин припиняється, оскільки поживні речовини вичерпуються та/або накопичуються продукти життєдіяльності в середовищах
«фаза смерті» кількість життєздатних (живих клітин) в культурі стаціонарної фази зменшується (зазвичай через токсичність продуктів життєдіяльності)

Щільність клітин можна зручно контролювати, використовуючи поглинання видимого світла (зазвичай при 600 нм)

Знімок екрана (240) .png

Малюнок 2.2.8: Крива щільності комірок

Різні середовища призведуть до різних темпів зростання та різної щільності стаціонарних фаз

Багаті середовища матимуть короткий (<1,0 години) подвоєння разів і призведе до більшої щільності клітин на стаціонарній фазі
Мінімальні середовища демонструватимуть повільне зростання (подвоєння разів ~ 1,0 години при 37° C) та низьку кінцеву щільність
Ефективне перемішування та аерація можуть збільшити кінцеву щільність клітин (ферментери можуть досягти більшої щільності, ніж колби шейкера).

	Мінімальний	LB	Приголомшливий
Фосфатні солі	16г	-	12г
солі амонію	1 г	-	-
Солі магнію	0,1 г	-	-
Глюкоза/гліцерин	4г	-	4г
Хлорид натрію	0,5 г	10 г	-
Ферментативний перетравлювач казеїну (молочного білка)	-	10 г	12г
дріжджовий екстракт	-	5г	24г
Приблизно подвоєння часу (хв)	60	45	30
Стаціонарна щільність фаз (А ₆₀₀)	3	7	15

Давайте подивимося на деякі сирі дані з культури кишкової палички, що росте в ферментері. Поглинання на 600 нм фіксувалося через різні проміжки часу:

Час (хвилини)	А ₆₀₀
0	0,09
18	0.102
78	0,124
142	0,253
205	0,487
255	1.02
322	1.98
378	3,95
446	5.88
504	6.76
564	7.2

Крива зростання виглядає так:

Скріншот (241) .png

Малюнок 2.2.9: Вибіркова крива зростання

Для того щоб розрахувати час подвоєння, нам потрібно знати область кривої зростання, для якої зростання є логарифмічним. Ми можемо оцінити це шляхом побудови даних поглинання за логарифмічною шкалою (журнал ₁₀). В цьому випадку наші дані будуть виглядати наступним чином:

Час (хвилини)	А ₆₀₀	Журнал ₁₀ А ₆₀₀
0	0,09	-1.05
18	0.102	-0.99
78	0,124	-0.91
142	0,253	-0.60
205	0,487	-0.31
255	1.02	0,01
322	1.98	0,30
378	3,95	0,60
446	5.88	0,77
504	6.76	0,83
564	7.2	0,86

Скріншот (242) .png

Малюнок 2.2.10: Зразок логарифмічної кривої зростання

У цьому випадку дані, здається, мають початковий період відставання з подальшим логарифмічним зростанням приблизно до 400 хвилин, потім швидкість сповільнюється. Іншими словами, крива журналу ₁₀ видається лінійною протягом періоду часу 100 - 400 хвилин, або близько того.

Ми можемо зручно визначити час подвоєння, повторюючи дані за цей період та перетворюючи A ₆₀₀ у значення журналу ₂.

Примітка

журнал _N (X) = журнал ₁₀ (X) /журнал ₁₀ (N)

Час (хвилини)	А ₆₀₀	Журнал ₁₀ А ₆₀₀	Журнал ₂ А ₆₀₀
0	0,09		-1.05
18	0.102	-0.99
78	0,124	-0.91	-3.01
142	0,253	-0.60	-1.98
205	0,487	-0.31	-1.04
255	1.02	0,01	0.029
322	1.98	0,30	0,99
378	3,95	0,60	1.98
446	5.88	0,77
504	6.76	0,83
564	7.2	0,86

Скріншот (243) .png

Малюнок 2.2.11: Зразок l і ₂ кривої зростання

Якщо прокласти пряму лінію через ці точки, нахил дасть нам швидкість зміни значень журналу ₂ А ₆₀₀ як функція часу:

Скріншот (244) .png

Малюнок 2.2.12: L лінійна підходить для кривої зростання журналу зразка ₂

Таким чином, для даної культури зростання (ухил) можна охарактеризувати як швидкість 0,0167 лог ₂ А ₆₀₀ /хв.
Тому зворотний нахил скаже нам, скільки хвилин потрібно культурі, щоб збільшити свою щільність на 1 колоду ₂ А ₆₀₀ одиниць поглинання.
Оскільки це журнал ₂, зміна одиниць поглинання 1 означає, що поглинання подвоїлося.

Тому зворотний нахил для ділянки колоди ₂ дає нам час, необхідний для поглинання культури в два рази (тобто час подвоєння)

Для цього експерименту час подвоєння становить 1/0.0167 або 59,9 хвилин. Це говорить про те, що засоби масової інформації, ймовірно, не дуже багаті (можливо, як мінімальні носії), однак остаточне поглинання вище, ніж очікувалося для мінімальних носіїв. Так, можливо, ЗМІ LB, але зростання було зроблено при більш низькій температурі (тобто призвело до уповільнення темпів зростання).

Важливі параметри для визначення:

А ₆₀₀ на стаціонарній фазі
A ₆₀₀ на ½ стаціонарної фази (зазвичай це час, обраний для стимулювання бактерій до вироблення рекомбінантних білків)
Подвоєння часу (сюжет журналу ₂ з А ₆₀₀ над логарифмічним діапазоном зростання, прийняти зворотний нахил)