2.3: Екстрахромосомні елементи, плазміди, селекційні маркери

• Включення походження реплікації (тобто E. coli orIC області) у кругову молекулу ДНК є механізмом мати екстрахромосомний елемент у прокаріотичній клітині.

Малюнок 2.3.1: OriC Екстрахромосомний елемент

• Такий екстрахромосомний елемент називається плазмідою, або вектором
• Плазміда використовує механізми клітини-господаря (тобто полімерази, хелікази, dNtP тощо) для прямої реплікації.

Малюнок 2.3.2: Вектор/плазміда

• Однак, оскільки додаткова робота по реплікації екстрахромосомного елемента є навантаженням на клітину, вона буде переповнена іншими клітинами, які не містять плазміду.
  • Оскільки в прокаріотичних клітині сегрегація плазмід є випадковою подією, можуть виникати дочірні клітини, які не містять плазміди, і вони ростуть швидше (поза конкуренцією) батьківської клітини.
  • Іншими словами, за відсутності інших тисків, через певний проміжок часу популяція клітин в культурі буде тими, які «втратили» плазміду.

Малюнок 2.3.3: Втрата плазміди

• У організмах з більш ніж однією хромосомою (еукаріоти) існують різноманітні механізми, що забезпечують належну сегрегацію хромосом, тобто переконатися, що дочірні клітини містять рівні числа всіх хромосом.

• Одним з основних механізмів є те, що кожна хромосома містить необхідні гени, і якщо вони втрачені, клітина не може вижити.

Стійкість до лікарських засобів

• На сьогоднішній день найпоширенішим підходом до підтримки плазмід є включення генів резистентності до ліків.
  • Вони також відомі як маркери, які можна вибрати, тобто ми можемо вибрати для їх присутності, включивши антибіотики в середовищі росту.

Ампіцилін

• Ампіцилін зв'язується і пригнічує ряд ферментів в бактеріальній мембрані, які беруть участь в синтезі грамнегативної клітинної стінки.
  • Тому правильна реплікація клітин не може відбуватися в присутності ампіциліну.
• Ген стійкості до ампіциліну (amp ^r) кодує фермент (b -лактамазу), який секретується в периплазматичний простір бактерії, де він каталізує гідроліз b -лактамного кільця ампіциліну.
  • Таким чином, генний продукт гена amp ^r руйнує антибіотик.
• З часом ампіцилін в культуральному середовищі або тарілці Петрі може бути істотно знищений b -лактамазою.
  • Коли це відбувається, можуть виникнути клітинні популяції, які «втратили» плазміду.

Малюнок 2.3.4: Резистентність до ампіциліну

Тетрациклін

• Тетрациклін зв'язується з білком 30S субодиниці рибосоми і пригнічує рибосомну транслокацію вздовж месенджерної РНК, яка кодує білок (тобто препарат перешкоджає нормальному трансляції або виробленню білків).
  • Ген резистентності до тетрацикліну (tet ^r) кодує 399 амінокислотний зовнішній мембранний асоційований білок грамнегативних клітин, що запобігає потраплянню антибіотика в клітину.
• Таким чином, цей ген резистентності до ліків не руйнує антибіотик. Тиск буде підтримуватися протягом усього процесу культури клітин, щоб зберегти плазміду, що містить ген, стійкий до препарату.

хлорамфенікол

• Хлорамфенікол зв'язується з рибосомальної субодиницею 50S і пригнічує синтез білка.
• Ген стійкості до хлорамфеніколу (Cm ^r) кодує білок, відомий у котячого білка.
  • Котячий білок - це тетрамерний цитозольний білок, який у присутності ацетилкоферменту А каталізує утворення гідроксилацетоксипохідних хлорамфеніколу, які не здатні зв'язуватися з рибосомою.
  • Як і у випадку з ампіциліном , продукт гена Cm ^r руйнує антибіотик.
  • Крім того, на експресію котячого білка впливає (вниз регулюється) присутність глюкози в середовищі.

Канаміцин і неоміцин

• Зв'язується з рибосомними компонентами і пригнічує синтез білка.
• Ген Kan ^r кодує білок, який секретується в периплазматичний простір і перешкоджає транспортуванню цих антибіотиків в клітину.
  • Як і резистентність до тетрацикліну, ген Kan ^r не руйнує антибіотик.

Коліцин Е1

• Це член загального класу речовин, відомих як бактеріоцини.
• Коліцин Е1 викликає летальні зміни мембрани бактерій.
  • Ген резистентності до ліків (CEA) кодує білок, який невідомим чином перешкоджає дії коліцину.

Прокаріотичні плазміди

• Окрім виготовлення плазміди за допомогою E. coli orIC області, існує природна плазміда кишкової палички, яка називається плазмідою Cole1.
  • Походження реплікації Cole1 є однонаправленим (на відміну від ORIC)
  • Реплікація з області Ori CoLe1 не вимагає асоційованих білків (наприклад, білка ДНК), таких як OriC, (але для цього потрібні специфічні молекули РНК).
• Залежно від точної області походження Cole1, яка вставляється в кругову молекулу ДНК, екстрахромосомний елемент буде підтримуватися з «низьким» або «високим» номером копії
• Ген rop поблизу походження Cole1 бере участь в регуляції реплікації.
  • Якщо область Ori Cole1 включає цей ген, то плазміда підтримується середнім номером копії 10-30 плазмід/клітина. Це вважається низьким номером копії.
  • Якщо область Ori Cole1 не має гена rop, то отримана плазміда підтримується середнім числом копій 100-200 плазмід/клітина. Це вважається високим типом копії номера плазміди.
• Якщо плазміда містить ген, який кодує білок (як гени резистентності до ліків), номер копії може впливати на кількість такого білка в клітині.

ПБр 322 (4.36 Кб)

• Одна з оригінальних клонуючих плазмід.
• Побудований шляхом лігування разом:
  • ген резистентності до тетрацикліну з плазміди PSc101
  • Cole1 і область краплі з плазміди Cole1
  • ген стійкості до ампіциліну з транспозону Tn3
• Містить як ампіцилін, так і гени резистентності до тетрацикліну (маркери).
• Містить унікальні сайти обмежень всередині і зовні цих маркерів.
• Містить область rop поблизу CoE1 ori, отже, має низьке число копії (10-30)
• Нумерація починається з унікального сайту обмеження eCoR I (GAATTC). Перший 'T' в цій послідовності є базовим числом «1».

Малюнок 2.3.5: ПБР322

Схема плазміди:

• У центрі - назва плазміди (зазвичай починається з нижнього регістру «p») та розмір у базових парах
• внутрішнє кільце забезпечує кліщі в інтервалах 1 Кілобаза (Кб), щоб дати уявлення про загальне розташування частин плазміди
• стрілки вказують гени, маркери, орі або реплікації, промотори, полілінкери, термінатори транскрипції та інші важливі або функціональні елементи
• зовнішнє кільце зазвичай вказує на розташування унікальних, або обмеженого числа (зазвичай <3), місць обмеження ендонуклеази. Рестрикційні ферменти, які мають більше трьох ділянок, не вказуватимуться. Майте на увазі, що ферменти, які не ріжуться взагалі, теж не будуть перераховані!

ПУК18/19 (2.69 Кб)

• Не вистачає гена rop поблизу області Ori Cole1. Таким чином, ця плазміда має тенденцію накопичуватися у великій кількості копій (100-200).
• Цей вектор містить лише маркер резистентності до ампіциліну.
• Цей вектор містить область полілінкера
  • Синтетична послідовність ДНК, яка містить кластеризацію унікальних сайтів розпізнавання рестрикційних ферментів
  • Дозволяє вставляти фрагменти ДНК, породжені різноманітними рестрикційними ендонуклеазними розщепленнями, в плазміду
  • PuC18 має полілінкер в одній орієнтації
  • PuC19 має той же полілінкер, але в протилежній орієнтації
  • Таким чином, фрагменти з унікальними місцями обмеження на кожному кінці можуть бути вставлені в певній орієнтації
  • Сайт Post I в amp ^або гені був мутований, щоб видалити його. Сайт eCOR I в позиції (1) був мутований, щоб видалити його. Це було зроблено для того, щоб зробити сайти обмежень в області полілінкера унікальними.
• Цей вектор також містить область промотора транскрипції з лак-оперону, яка дозволяє вставляти та транскрибувати/перекладати чужорідні гени.
  • Полілінкерна область знаходиться лише нижче за течією (3') до промоутера лаку
  • Вставлені гени можна транскрибувати з цього промотора

Малюнок 2.3.6: PUC18/19