2.3: Екстрахромосомні елементи, плазміди, селекційні маркери

Last updated

Oct 24, 2022
Save as PDF
- 2.2: Ріст і розмноження бактерій
- 2.4: Центральна догма та генетичний код

$\newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} }$

$\newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}}$

$\newcommand{\id}{\mathrm{id}}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}$

$\newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}$

$\newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}$

$\newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}$

$\newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}$

$\newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}$

$\newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\id}{\mathrm{id}}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}$

$\newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}$

$\newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}$

$\newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}$

$\newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}$

$\newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}$

$\newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

Включення походження реплікації (тобто E. coli orIC області) у кругову молекулу ДНК є механізмом мати екстрахромосомний елемент у прокаріотичній клітині.

Скріншот (245) .png

Малюнок 2.3.1: OriC Екстрахромосомний елемент

Такий екстрахромосомний елемент називається плазмідою, або вектором
Плазміда використовує механізми клітини-господаря (тобто полімерази, хелікази, dNtP тощо) для прямої реплікації.

Скріншот (246) .png

Малюнок 2.3.2: Вектор/плазміда

Однак, оскільки додаткова робота по реплікації екстрахромосомного елемента є навантаженням на клітину, вона буде переповнена іншими клітинами, які не містять плазміду.
- Оскільки в прокаріотичних клітині сегрегація плазмід є випадковою подією, можуть виникати дочірні клітини, які не містять плазміди, і вони ростуть швидше (поза конкуренцією) батьківської клітини.
- Іншими словами, за відсутності інших тисків, через певний проміжок часу популяція клітин в культурі буде тими, які «втратили» плазміду.

Скріншот (247) .png

Малюнок 2.3.3: Втрата плазміди

У організмах з більш ніж однією хромосомою (еукаріоти) існують різноманітні механізми, що забезпечують належну сегрегацію хромосом, тобто переконатися, що дочірні клітини містять рівні числа всіх хромосом.

Одним з основних механізмів є те, що кожна хромосома містить необхідні гени, і якщо вони втрачені, клітина не може вижити.

Стійкість до лікарських засобів

На сьогоднішній день найпоширенішим підходом до підтримки плазмід є включення генів резистентності до ліків.
- Вони також відомі як маркери, які можна вибрати, тобто ми можемо вибрати для їх присутності, включивши антибіотики в середовищі росту.

Ампіцилін

Ампіцилін зв'язується і пригнічує ряд ферментів в бактеріальній мембрані, які беруть участь в синтезі грамнегативної клітинної стінки.
- Тому правильна реплікація клітин не може відбуватися в присутності ампіциліну.
Ген стійкості до ампіциліну (amp ^r) кодує фермент (b -лактамазу), який секретується в периплазматичний простір бактерії, де він каталізує гідроліз b -лактамного кільця ампіциліну.
- Таким чином, генний продукт гена amp ^r руйнує антибіотик.
З часом ампіцилін в культуральному середовищі або тарілці Петрі може бути істотно знищений b -лактамазою.
- Коли це відбувається, можуть виникнути клітинні популяції, які «втратили» плазміду.

Скріншот (248) .png

Малюнок 2.3.4: Резистентність до ампіциліну

Тетрациклін

Тетрациклін зв'язується з білком 30S субодиниці рибосоми і пригнічує рибосомну транслокацію вздовж месенджерної РНК, яка кодує білок (тобто препарат перешкоджає нормальному трансляції або виробленню білків).
- Ген резистентності до тетрацикліну (tet ^r) кодує 399 амінокислотний зовнішній мембранний асоційований білок грамнегативних клітин, що запобігає потраплянню антибіотика в клітину.
Таким чином, цей ген резистентності до ліків не руйнує антибіотик. Тиск буде підтримуватися протягом усього процесу культури клітин, щоб зберегти плазміду, що містить ген, стійкий до препарату.

хлорамфенікол

Хлорамфенікол зв'язується з рибосомальної субодиницею 50S і пригнічує синтез білка.
Ген стійкості до хлорамфеніколу (Cm ^r) кодує білок, відомий у котячого білка.
- Котячий білок - це тетрамерний цитозольний білок, який у присутності ацетилкоферменту А каталізує утворення гідроксилацетоксипохідних хлорамфеніколу, які не здатні зв'язуватися з рибосомою.
- Як і у випадку з ампіциліном , продукт гена Cm ^r руйнує антибіотик.
- Крім того, на експресію котячого білка впливає (вниз регулюється) присутність глюкози в середовищі.

Канаміцин і неоміцин

Зв'язується з рибосомними компонентами і пригнічує синтез білка.
Ген Kan ^r кодує білок, який секретується в периплазматичний простір і перешкоджає транспортуванню цих антибіотиків в клітину.
- Як і резистентність до тетрацикліну, ген Kan ^r не руйнує антибіотик.

Коліцин Е1

Це член загального класу речовин, відомих як бактеріоцини.
Коліцин Е1 викликає летальні зміни мембрани бактерій.
- Ген резистентності до ліків (CEA) кодує білок, який невідомим чином перешкоджає дії коліцину.

Прокаріотичні плазміди

Окрім виготовлення плазміди за допомогою E. coli orIC області, існує природна плазміда кишкової палички, яка називається плазмідою Cole1.
- Походження реплікації Cole1 є однонаправленим (на відміну від ORIC)
- Реплікація з області Ori CoLe1 не вимагає асоційованих білків (наприклад, білка ДНК), таких як OriC, (але для цього потрібні специфічні молекули РНК).
Залежно від точної області походження Cole1, яка вставляється в кругову молекулу ДНК, екстрахромосомний елемент буде підтримуватися з «низьким» або «високим» номером копії
Ген rop поблизу походження Cole1 бере участь в регуляції реплікації.
- Якщо область Ori Cole1 включає цей ген, то плазміда підтримується середнім номером копії 10-30 плазмід/клітина. Це вважається низьким номером копії.
- Якщо область Ori Cole1 не має гена rop, то отримана плазміда підтримується середнім числом копій 100-200 плазмід/клітина. Це вважається високим типом копії номера плазміди.
Якщо плазміда містить ген, який кодує білок (як гени резистентності до ліків), номер копії може впливати на кількість такого білка в клітині.

ПБр 322 (4.36 Кб)

Одна з оригінальних клонуючих плазмід.
Побудований шляхом лігування разом:
- ген резистентності до тетрацикліну з плазміди PSc101
- Cole1 і область краплі з плазміди Cole1
- ген стійкості до ампіциліну з транспозону Tn3
Містить як ампіцилін, так і гени резистентності до тетрацикліну (маркери).
Містить унікальні сайти обмежень всередині і зовні цих маркерів.
Містить область rop поблизу CoE1 ori, отже, має низьке число копії (10-30)
Нумерація починається з унікального сайту обмеження eCoR I (GAATTC). Перший 'T' в цій послідовності є базовим числом «1».

Знімок екрана (250) .png

Малюнок 2.3.5: ПБР322

Схема плазміди:

У центрі - назва плазміди (зазвичай починається з нижнього регістру «p») та розмір у базових парах
внутрішнє кільце забезпечує кліщі в інтервалах 1 Кілобаза (Кб), щоб дати уявлення про загальне розташування частин плазміди
стрілки вказують гени, маркери, орі або реплікації, промотори, полілінкери, термінатори транскрипції та інші важливі або функціональні елементи
зовнішнє кільце зазвичай вказує на розташування унікальних, або обмеженого числа (зазвичай <3), місць обмеження ендонуклеази. Рестрикційні ферменти, які мають більше трьох ділянок, не вказуватимуться. Майте на увазі, що ферменти, які не ріжуться взагалі, теж не будуть перераховані!

ПУК18/19 (2.69 Кб)

Не вистачає гена rop поблизу області Ori Cole1. Таким чином, ця плазміда має тенденцію накопичуватися у великій кількості копій (100-200).
Цей вектор містить лише маркер резистентності до ампіциліну.
Цей вектор містить область полілінкера
- Синтетична послідовність ДНК, яка містить кластеризацію унікальних сайтів розпізнавання рестрикційних ферментів
- Дозволяє вставляти фрагменти ДНК, породжені різноманітними рестрикційними ендонуклеазними розщепленнями, в плазміду
- PuC18 має полілінкер в одній орієнтації
- PuC19 має той же полілінкер, але в протилежній орієнтації
- Таким чином, фрагменти з унікальними місцями обмеження на кожному кінці можуть бути вставлені в певній орієнтації
- Сайт Post I в amp ^або гені був мутований, щоб видалити його. Сайт eCOR I в позиції (1) був мутований, щоб видалити його. Це було зроблено для того, щоб зробити сайти обмежень в області полілінкера унікальними.
Цей вектор також містить область промотора транскрипції з лак-оперону, яка дозволяє вставляти та транскрибувати/перекладати чужорідні гени.
- Полілінкерна область знаходиться лише нижче за течією (3') до промоутера лаку
- Вставлені гени можна транскрибувати з цього промотора

Скріншот (251) .png

Малюнок 2.3.6: PUC18/19