2.6: Лак Оперон; CAP сайт; ДНК-сліди

Last updated
Save as PDF

Page ID: 7557

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Лак оперон кишкової палички

Знімок екрана (260) .png

Малюнок 2.6.1: Лак Оперон

Лак-Z коди для b -галактозидази, яка є ферментом, який розщеплює b -галактозиди (наприклад, лактозу).
lac Y коди для пермеази, яка бере участь у транспортуванні b -галактозидів в клітину.
Лак-А коди для b -галактозиду трансацетилази, яка ацетилює b -галактозиди.

Мутація в лаку Z або лаку Y може призвести до лаку ^- генотипу, тобто клітин, які не можуть використовувати b -галактозиди як поживну речовину.
Лак-А-мутант, який не має активності трансацетилази, все ще може утилізувати b -галактозиди (це все ще лак+ генотип). Його роль в метаболізмі b галактозидів не ясна.

Промоутер

область ДНК, яка бере участь у зв'язуванні РНК-полімерази для початку транскрипції.

Термінатор

послідовність ДНК, яка змушує РНК-полімеразу припиняти транскрипцію.

Скупчення трьох генів, lac ZYA, транскрибується в одну мРНК (поліцистронічне повідомлення) від промотора тільки вище за течією від гена lac Z.
При відсутності індуктора кластер генів не транскрибується.
Коли індуктор додається (наприклад, лактоза, або негідролізуючий аналоговий ізопропілтіогалактозид - IPTG) транскрипція починається з одного промотора (лак Р) і проходить через гени лаку ZYA до послідовності термінатора, розташованої нижче за течією Лак А ген.

Примітка

Лак-ZYA мРНК має період напіврозпаду ~ 3 хвилини, що дозволяє індукції відносно швидко скасовуватися (тобто клітини припиняють виробляти ферменти швидко після зупинки індукції).

Вправа 2.6.1

З якою молекулою взаємодіє індуктор (лактоза), щоб впливати на транскрипційну регуляцію (тобто індукцію лак-оперону)?

Відповідь: Це не b-галактозидаза, пермаза або трансацетилаза, скоріше це окремий білок, який називається білком репресора.

Гени лаку контролюються механізмом, званим негативною регуляцією.
- Це означає, що вони транскрибуються, якщо вони не вимкнені білком регулятора.
- Мутація, яка інактивує білок регулятора, викликає постійну експресію генів lac ZYA.

Оскільки функція білка регулятора полягає в запобіганні експресії, його називають білком репресора.

Існує два типи генів в лак-опероні:

Структурні гени - вони кодують ферменти, необхідні для деякого біохімічного шляху (наприклад, лак Z, Y і A).
Гени-регулятори - вони кодують для білків, що беруть участь в регуляції структурних генів.

Мутації в структурних генах зазвичай впливають на функцію тільки цього структурного гена. Мутації в генах-регуляторах можуть впливати на експресію всіх структурних генів в опероні.

лак I - ген-регулятор лак-оперона.

Цей ген розташований лише вище за течією області промотора для структурних генів лаку.
Ген Lac I має свій промотор (конститутивний) і термінатор.
Він робить моноцистроническое повідомлення, і кодує на один білок - білок лак-репресор.

Вирішальна особливість лакової «схеми управління» полягає в подвійній особливості білка репресора лаку I:

Це може запобігти транскрипції
Він може розпізнавати та зв'язувати індуктор малих молекул (лактоза або IPTG)

Профілактика транскрипції лак-репресором

лак-репресор (активний як тетрамерний білок) зв'язується з послідовністю ДНК, яка називається оператором (область лаку О).
- Область оператора лежить між областю промотора лаку (ділянкою зв'язування РНК-полімерази та ініціації транскрипції) та геном Lac Z.
- Перші 26 пар основ гена lac Z складають операторну область.

Коли репресор зв'язується з областю оператора, його наявність запобігає ініціюванню транскрипції РНК-полімерази у промотора.

Це не те, що протеїн-репресор «блокує» рух РНК-полімерази через ген lac Z.
Репресорне зв'язування та зв'язування РНК-полімерази (з промотором) є взаємовиключними в області лак-промотора/оператора (lac PO).

Як змінюється взаємодія репресор/оператора в присутності молекули індуктора?

Індуктор може зв'язуватися з репресором, утворюючи комплекс репресор/індуктор, який більше не асоціюється з оператором.
- Ключовою особливістю цієї взаємодії є те, що білок репресора має два місця зв'язування, один для індуктора і один для оператора.
- Коли індуктор зв'язується на своєму місці, він змінює конформацію білка репресора таким чином, що сайт зв'язування оператора має значно знижену спорідненість до області оператора ДНК.
- Такий вид контролю називається аллостеричним контролем.
- Результатом є те, що при додаванні індуктора репресор перетворюється в форму, яка звільняє від оператора.

Скріншот (261) .png

Малюнок 2.6.2: Індуктор

Позитивний контроль лак-оперона здійснює комплекс Camp-cap

кишкова паличка воліє глюкозу перед іншими джерелами вуглецю.

Коли глюкоза потрапляє в клітину кишкової палички, вона утилізується безпосередньо без індукції будь-яких нових ферментів.

Коли кишкова паличка вирощується на глюкозі, якщо додається інший цукор (наприклад, лактоза), індукція ферментів для утилізації іншого цукру не відбувається, поки глюкоза не буде витрачена.

Коли кишкова паличка голодує за глюкозою, вона синтезує незвичайний нуклеотид: циклічний 3'5' аденозинмонофосфат (циклічний AMP, або цАМФ):

Скріншот (262) .png

Малюнок 2.6.3: цАМФ

У бактерій підвищення рівня цАМФ здається «тривожним» сигналом, що вказує на низький рівень глюкози:

Скріншот (263) .png

Малюнок 2.6.4: Взаємодія рівня цАМФ та лак-оперона

Дибутирил цАМФ

аналог цАМФ, який може проходити через мембрану кишкової палички і в клітину.
Якщо це додати до середовищ, що містять глюкозу і лактозу, це призведе до індукції лак-оперона.
Таким чином, він імітує хімічне повідомлення, яке обманює кишкову паличку реагувати так, ніби рівень глюкози був низьким.

Були виділені мутанти кишкової палички, які не можуть бути спонукані метаболізувати будь-який цукор, крім глюкози. Існували дві загальні категорії мутантів:

Клас I. Дефектний в ферменті аденілатциклази. Ці мутанти не в змозі зробити цАМФ навіть тоді, коли концентрація глюкози низька.
Клас II. Не вистачає певного білка, відомого як білок рецепторів цАМФ (СРБ) або, також відомий як білок рецепторів катаболітів (СРБ).

Максимальна транскрипція з лак-оперона вимагає наявності комплексу Camp/CRP.
- Комплекс Camp/CRP зв'язується з певною послідовністю в області контролю лаку, яка називається сайтом "CAP".
- Сайт CAP знаходиться лише вище за течією від місця зв'язування РНК полімерази.
- Мутації в місці CAP, що перешкоджають зв'язуванню Camp-CRP, також запобігають високому рівню експресії лак-оперону.
Таким чином, зв'язаний комплекс Camp/CRP активує транскрипцію (позитивний контроль), тоді як зв'язаний лак-репресор пригнічує транскрипцію (негативний контроль).
- Комплекс Camp/CRP має спорідненість до ДНК та РНК pol.
- Підсилює комплексне утворення РНК pol з областю промотора ДНК.

Індукція лак-оперона аналогами лактози

Лак-оперон може бути індукований лактозою
- b -галактозидаза (продукт гена lac Z) метаболізує лактозу
- Коли рівень лактози знижується, лак-оперон знову пригнічується лак-репресором (продукт гена лаку I)
Неметаболізовані аналоги лактози можуть постійно індукувати (тобто де-репресувати) лак оперон
- ізопропіл б -тіогалактозид, або ІПТГ, є неметаболізованою аналогом лактози

Експерименти ДНК «слідів»

Якщо білок зв'язується з областю ДНК, він може захистити цю область ДНК від перетравлення за допомогою dnase (dNaSe I: ендонуклеаза на ділянках, прилеглих до піримідинових нуклеотидів).
- Фрагмент ДНК може бути позначений на 5' закінчується ³² P, а потім мітка може бути переважно видалена з одного кінця (тобто 3' кінця гена) відповідною рестрикційної ендонуклеазою.
- Якщо цей фрагмент ДНК з міткою на одному конкретному кінці утворює комплекс з ДНК зв'язуючим білком білок, білок захистить область ДНК, з якою він зв'язується, від травлення dNaSe I.
- Травлення робиться так, щоб бути неповним, для цілей цієї дискусії уявіть, що кожна молекула ДНК розщеплюється лише один раз. Крім того, місце розщеплення вибирається випадковим чином з доступних ділянок.
- Фрагменти ДНК, відокремлені і проаналізовані за розміром (за допомогою гелевого електрофорезу) після травлення вказують на захищену область:

Скріншот (264) .png

Малюнок 2.6.5: ДНК-сліди

Результати експериментів з друку слідів

Лак-ДНК інкубується або протеїном Camp/Cap, або РНК-полімеразою, або білком Lac I репресора:

Скріншот (265) .png

Малюнок 2.6.6: Лак репресор з цАМФ

РНК-полімераза взаємодіє зі специфічними послідовностями промоторів і створює «слід» над областю ~ 70 пар основ.

Цей захист спостерігався більш очевидним на одній пасмі, ніж на іншій (тобто якщо інша пасмо була позначена, результати не показали стільки захисту).
Ця область захисту ДНКАзи включала ділянки в ДНК, з яких експерименти з мутагенезу виробляли або «вгору» регуляцію, або «вниз» регуляцію сили промотора.
Ці мутагенні «гарячі» точки, що впливають на силу промотора, були розташовані на позиціях -10 або -30 вище за течією від місця початку транскрипції (позиція +1 на наведеній вище схемі):

Скріншот (266) .png

Малюнок 2.6.7: Мутації сили промоутера

Промоутери можна класифікувати за їх «силі».
Це стосується відносної частоти ініціації транскрипції (події ініціації транскрипції в хвилину) і пов'язано з спорідненістю РНК-полімерази для промоторної області.
Багато промоутерів в E. coli були охарактеризовані і була визначена послідовність промоутерів «консенсусу»:

Скріншот (267) .png

Малюнок 2.6.8: Сила промоутера консенсусу

Примітка

Лак-промоутер є відносно слабким промоутером.

РНК-полімераза

РНК-полімераза E. coli - це голофермент, що складається з субодиниць b ', b, a (димер) і s ⁷⁰.
- Субодиниця s ⁷⁰ - це субодиниця, яка зв'язується з промоторною областю, але не в змозі ініціювати синтез РНК.
- Після того, як субодиниця s ⁷⁰ зв'язується, інші субодиниці зв'язуються, утворюючи функцію РНК-полімерази.
- Після того, як приблизно 10 пар основ були транскрибовані s ⁷⁰ субодиниці листя і серцевина полімерази продовжується.

Регіон оператора Lac

Область лак-оператора складається з (недосконалої) області перевернутого повторення.
Не дивно, що активні молекули репресора складаються з гомодимера.
- У структурі гомодимера є пара областей a -спіралі, які вставляються в сусідні великі канавки ДНК.
- Поділ становить приблизно 34 ангстреми один від одного.