1.6: Перетворення клітин

Last updated

Oct 24, 2022
Save as PDF
- 1.5: Лігування продуктів
- 1.7: Щеплення

Nathan Reyna, Ruth Plymale, & Kristen Johnson
Ouachita Babtist University & University of New Hampshire

$\newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} }$

$\newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}}$

$\newcommand{\id}{\mathrm{id}}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}$

$\newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}$

$\newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}$

$\newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}$

$\newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}$

$\newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}$

$\newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\id}{\mathrm{id}}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}$

$\newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}$

$\newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}$

$\newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}$

$\newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}$

$\newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}$

$\newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

Трансформація клітин: Zippy трансформація Z-компетентних клітин

Введення чужорідної ДНК в бактерії E. coli

Бактеріальна трансформація - це коли клітини забирають чужорідні ДНК з навколишнього середовища. Клітини можуть виражати генетичну інформацію, яку вони отримали від цієї чужорідної ДНК. (Термофішер)

ПОРАДИ ПЕРЕД ПОЧАТКОМ:

Залежно від ситуації, особливо коли ви переходите до фази аналізу і запитуєте інший тип бактеріального шасі, ви будете використовувати різні компетентні клітини. Переконайтеся, що ви знаєте, які клітини ви використовуєте і чи є певний протокол для типу комірки. (Компетентні бактерії, описані в цьому протоколі, - це компетентні Zippy JM109, ZymoResearch)
Більшість плазмід несуть ген маркера для специфічної стійкості до антибіотиків. Доповнюючи середовище росту антибіотиком за вибором, розмножуватимуться лише клітини, що містять цікавить плазміду. Ви повинні знати стійкість до антибіотиків, пов'язану з вашим плазмідним хребтом!! (Див. Додаток I)

Всі грамотні осередки зберігаються в морозильній камері -80. Зверніться за допомогою до інструктора, коли будете готові отримати грамотні клітини. Ви повинні мати ДВС, по-перше!

Матеріали	Температура зберігання
Зіппі Компетентні клітини бактерій	-80° C
Суміш для лігування	свіжа/-20°C
LB Агар-пластина з антибіотиком	Кімнатна темпа/ 37° C
СОЦ	4 °C/Кімнатна температура
Стерильні скляні намистини	Кімната Темп

Процедура: Прочитайте кожен крок, перш ніж почати!

1) Переконайтеся, що у вас тепла тарілка. Попередньо підігрійте, помістивши його в інкубатор 37 ° C або вийнявши при кімнатній температурі перед початком процедури. Дивіться кольорове кодування (Додаток I), щоб переконатися, що у вас є відповідний тип пластини LB+антибіотик!

2) Отримайте лід, потім запитуйте клітини/Нехай клітини розморожуються протягом 1-2 хвилин на льоду. - 50 $\mu L$ клітин можна розділити на 2 трубки по 25 $\mu L$ кожна для двох різних перетворень, якщо їх використовувати негайно для перетворення різних плазмід. (Якщо у вас немає двох плазмід для перетворення, подумайте про те, щоб поділитися з іншою командою.)

3) До повного розморожування клітин додати 1 - 5 г $\mu L$ лігаційної (плазмідної) суміші безпосередньо в клітини (не додавати в бічну частину трубки). Для досягнення найкращих результатів додайте плазмідну лігування до клітин, поки вони ще сльотаві.

4) Інкубувати на льоду 5 хвилин.

5) Додайте $\mu L$ 200 носіїв SOC без антибіотиків до суміші лігування клітин.
(Кількість SOC = ~ 4X об'єм комірки+плазмідна суміш; таким чином, для перетворення 25 мкл потрібно лише 120ul)

6). Інкубуйте з легким струшуванням (200-300 об/хв) протягом 1-2 годин при 37° C. (1 година буде працювати добре, але ви отримаєте більш високу ефективність трансформації з 2-годинним зростанням). Пропустіть цей крок, якщо використовуєте резистентність до ампіциліну, і перейдіть безпосередньо до кроку 7.

7) Поширюйте трансформовані клітини за допомогою скляних кульок на марковану підігріту (22-37° C) пластину, що містить антибіотик. Дайте тарілкам висохнути (37° C), перш ніж перевертати пластини догори дном. (Ви не хочете, щоб медіа/бактерії капали на кришку. Ви можете перевернути тарілки рано наступного дня, якщо це необхідно.)

8) Інкубувати протягом ночі (18-20 годин) при 37° C. На наступний день дістаньте тарілки з інкубатора, закрийте кришки параплівкою і зберігайте при температурі 4°С.

На наступний день: Всі колонії повинні бути приблизно однакового розміру (діаметра). Не рідкість при 3А збірці побачити лише від 1 до 10 колоній.