Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

1.5: Лігування продуктів

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    6952

    • Nathan Reyna, Ruth Plymale, & Kristen Johnson
    • Ouachita Babtist University & University of New Hampshire
    \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

    Лігування продуктів

    Приєднання 2 молекул ДНК, каталізованих ДНК-лігазою

    Цей процес утворює фосфодіефірний зв'язок між 3' гідроксилом і 5' фосфатом сусідніх ниток ДНК, створюючи рекомбінантну ДНК. (НЕБ)

    Відео-приклад виконання перев'язки

    Матеріали Температура зберігання
    Вода Кімната Темп
    Буфер лігування ДНК 10X T4 -20° C
    Лінеаризована плазмідна магістраль
    (підсилювач, хлор, людина, тест)    		 -20° C
    Подвійні перетравлені фрагменти ДНК -20° C
    Т4 ДНК Ліга -20° C

    ПОРАДИ ПЕРЕД ПОЧАТКОМ:

    Найкраще дорівнює (1:1) молярна кількість кожної вставки. Однак, 1\(\mu L\) з кожної перетравленої вставки зазвичай використовується для лігування і отримує послідовні результати. Якщо ваші деталі різко відрізняються за розміром, можливо, ви захочете відрегулювати молярну кількість. (Якщо ви не отримуєте хороших результатів/колоній після трансформації, почніть дивитися на зміну молярного співвідношення ваших вставок. Використовуйте NeBioCalculator для обчислення молярних коефіцієнтів.)

    Порядок дій

    1. Відтайте 10X T4 Буфер для лігування ДНК при кімнатній температурі, а потім зберігайте його на льоду до потреби. Залиште ДНК лігазу (фермент) в блоці морозильної камери до безпосередньої необхідності; завжди тримайте холод!

    2. Завжди спочатку додайте воду та буфер. Буфер перед використанням необхідно повністю розморозити і перемішати:

    5\(\mu L\) води (вода до 10ul, якщо об'єми вставки регулюються)
    1\(\mu L\) з 10X буфера лігування ДНК
    1\(\mu L\) (25ng) лінеаризованої плазміди (призначення)\(\mu L\) хребта
    1 з вставити A (перетравлюється відповідними ферментами/денатурованими)
    1\(\mu L\) вставку B (перетравлюється відповідними ферментами/денатурованими)
    1\(\mu L\) Т4 ДНК-лігази (фактичний фермент)

    3. Інкубувати при кімнатній температурі від 1 години до 2 годин. Перев'язки можуть тривати протягом ночі або довше, якщо зберігати при 4° C (в холодильнику). Це працює найкраще.

    4. Тепло інактивує реакцію при 65° C (або 80° C) протягом 10 хвилин. (Необов'язково, але компанія рекомендується.)

    5. Зразки можна зберігати при -20° C або використовувати негайно в протоколі перетворення Zippy. Найкраще, якщо ви відразу перетворите 5\(\mu L\) своєї реакції в тюбик зіппі клітин. (Буфер лігування може знизити ефективність перетворення. Використання більше 5 мкл може фактично знизити ефективність трансформації)