1.5: Лігування продуктів

Last updated

Oct 24, 2022
Save as PDF
- 1.4: Завантаження та запуск гелю
- 1.6: Перетворення клітин

Nathan Reyna, Ruth Plymale, & Kristen Johnson
Ouachita Babtist University & University of New Hampshire

$\newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} }$

$\newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}}$

$\newcommand{\id}{\mathrm{id}}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}$

$\newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}$

$\newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}$

$\newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}$

$\newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}$

$\newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}$

$\newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\id}{\mathrm{id}}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}$

$\newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}$

$\newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}$

$\newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}$

$\newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}$

$\newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}$

$\newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

Лігування продуктів

Приєднання 2 молекул ДНК, каталізованих ДНК-лігазою

Цей процес утворює фосфодіефірний зв'язок між 3' гідроксилом і 5' фосфатом сусідніх ниток ДНК, створюючи рекомбінантну ДНК. (НЕБ)

Відео-приклад виконання перев'язки

Матеріали	Температура зберігання
Вода	Кімната Темп
Буфер лігування ДНК 10X T4	-20° C
Лінеаризована плазмідна магістраль (підсилювач, хлор, людина, тест)	-20° C
Подвійні перетравлені фрагменти ДНК	-20° C
Т4 ДНК Ліга	-20° C

ПОРАДИ ПЕРЕД ПОЧАТКОМ:

Найкраще дорівнює (1:1) молярна кількість кожної вставки. Однак, 1 $\mu L$ з кожної перетравленої вставки зазвичай використовується для лігування і отримує послідовні результати. Якщо ваші деталі різко відрізняються за розміром, можливо, ви захочете відрегулювати молярну кількість. (Якщо ви не отримуєте хороших результатів/колоній після трансформації, почніть дивитися на зміну молярного співвідношення ваших вставок. Використовуйте NeBioCalculator для обчислення молярних коефіцієнтів.)

Порядок дій

1. Відтайте 10X T4 Буфер для лігування ДНК при кімнатній температурі, а потім зберігайте його на льоду до потреби. Залиште ДНК лігазу (фермент) в блоці морозильної камери до безпосередньої необхідності; завжди тримайте холод!

2. Завжди спочатку додайте воду та буфер. Буфер перед використанням необхідно повністю розморозити і перемішати:

5 $\mu L$ води (вода до 10ul, якщо об'єми вставки регулюються)
1 $\mu L$ з 10X буфера лігування ДНК
1 $\mu L$ (25ng) лінеаризованої плазміди (призначення) $\mu L$ хребта
1 з вставити A (перетравлюється відповідними ферментами/денатурованими)
1 $\mu L$ вставку B (перетравлюється відповідними ферментами/денатурованими)
1 $\mu L$ Т4 ДНК-лігази (фактичний фермент)

3. Інкубувати при кімнатній температурі від 1 години до 2 годин. Перев'язки можуть тривати протягом ночі або довше, якщо зберігати при 4° C (в холодильнику). Це працює найкраще.

4. Тепло інактивує реакцію при 65° C (або 80° C) протягом 10 хвилин. (Необов'язково, але компанія рекомендується.)

5. Зразки можна зберігати при -20° C або використовувати негайно в протоколі перетворення Zippy. Найкраще, якщо ви відразу перетворите 5 $\mu L$ своєї реакції в тюбик зіппі клітин. (Буфер лігування може знизити ефективність перетворення. Використання більше 5 мкл може фактично знизити ефективність трансформації)