Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

1.17: ІФА

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    6256

    • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

    Цілі навчання

    Цілі:

    • Продемонструвати силу ІФА як біомедичного діагностичного інструменту.
    • Провести ІФА.
    • Проаналізуйте результати ІФА і поставте діагноз на підставі отриманих результатів.

    Результати навчання студентів:

    Після закінчення цієї лабораторії студенти зможуть:

    • Опишіть, як працює ІФА.
    • З огляду на набір даних, інтерпретувати результати ІФА.

    Вступ

    ІФА (імуноферментний аналіз) - це імунологічна методика, яка використовується для виявлення наявності та концентрації антигену або антитіла у зразку. Сила ІФА заснована на надзвичайній специфічності взаємодії антиген-антитіло. ІФА мають широке застосування, особливо як медичні діагностичні засоби.

    Малювання реакцій в аналізі ІФА: антиген пов'язаний антитілом, яке пов'язане іншим антитілом, пов'язаним з ферментом. Фермент перетворює субстрат в продукт
    Малюнок 1. ІФА реакції

    Ця лабораторія являє собою моделювання ІФА, що проводиться пацієнтам, щоб визначити, чи могли вони піддаватися впливу вірусу ВІЛ. Пацієнти, які зазнали впливу вірусу (чужорідного антигену), вироблять антитіла до вірусу ВІЛ, а антитіла циркулюють у крові. Тестуючи зразки крові пацієнта, наявність або відсутність цих антитіл можна виміряти за допомогою ІФА.

    У проведеному для цієї лабораторії ІФА антиген (від вірусу ВІЛ) адсорбується на поверхні пластикових лунок (на 8-луновій смузі або 96-луночній пластині). Додаються зразки сироватки крові пацієнта (які можуть містити антитіла до антигену). Якщо антитіла присутні, то утворюються комплекси антиген-антитіла (імуносорбентний процес). Виявлення цих комплексів здійснюється додаванням вторинного антитіла, яке виявляє всі антитіла людини. Для полегшення виявлення вторинне антитіло було ковалентно пов'язане з ферментом. Коли фермент зв'язується з його субстратом, відбувається реакція на створення кольорового продукту. Підсумовуючи, для пацієнтів з ВІЛ антитіла в їх крові зв'язуються з антигеном ВІЛ, вторинне антитіло зв'язується з антитілами людини, а фермент буде виробляти кольоровий продукт, який легко візуалізувати. Для пацієнтів, які не мають антитіл до антигену ВІЛ, антитіла на першій стадії не зв'язуються і в результаті не виробляється кольоровий продукт.

    Клінічне застосування

    Сценарій: Ви працюєте в клініці і приходять двоє пацієнтів, які мали можливий вплив ВІЛ. ІФА є першим методом скринінгу антитіл до ВІЛ, оскільки він використовує менш дорогі матеріали та обладнання, ніж інші діагностичні процедури (наприклад, Western Blot або ПЛР). Ви берете зразок крові та центрифугуєте його, щоб відокремити сироватку крові від еритроцитів, і тепер будете проводити ІФА, перевіряючи сироватку на наявність антитіл до ВІЛ.

    Матеріали

    фото матеріалів, які будуть присутні у вашій лабораторії. Вона включає в себе мікропіпетку і наконечники, пляшку для промивання, стійку з мікрофужними трубками, а також лунки у вигляді смужки.
    Малюнок 2. Матеріали лабораторії ELISA

    Реагенти

    Зразки в мікрофужних пробірках

    • (ЗЕЛЕНИЙ) - Позитивний контроль: Сироватка з антитілами до антигену ВІЛ
    • (ЖОВТИЙ) - Негативний контроль: Сироватка без антитіл до антигену ВІЛ
    • (PINK) - Сироватка крові пацієнта А (потенційні первинні антитіла)
    • (BLUE) - сироватка крові пацієнта B (потенційне первинне антитіло)
    • (CLEAR) - Вторинні антитіла: Анти-людський імуноглобулін, пов'язаний з ферментом
    • (БУРШТИН) - Підкладка:
    • Тетраметилбензидин (TMB) хромогенний субстрат

    Обладнання

    • 8-луночкові ІФА смужки (антиген), покриті ВІЛ-білком
    • Мікропіпетка Р200
    • Коробка наконечників піпеток P200
    • Стійка для мікроцентрифуги зі зразками
    • Пляшки для бризок з буфером для прання PBS
    • Відро для відходів для наконечників
    • Каструля для миття смуг
    • Паперові рушники

    Порядок дій

    Крок 1: Антиген покриття до пластини (інактивовані білки ВІЛ) * Цей крок був завершений для вас*

    1. 200-мкл інактивованих білки ВІЛ (антигени) були додані в кожну лунку 8-луночної ІФА смужки
    2. Смужку накривають поліетиленовою плівкою і витримують при кімнатній температурі протягом 1 години.

    Крок 2: Блокуйте неспецифічне зв'язування антитіл * Цей крок для вас*

    1. Вміст 8-луночної смуги спорожняли, перевертаючи догори дном і мерехтячи, поки більше не було рідини.
    2. Блокувальне рішення було додано до кожної свердловини. Цей крок запобіжить неспецифічне зв'язування антитіл.

    Крок 3: Додайте зразок (з можливим первинним антитілом)

    Почніть експеримент тут: Ваша ІФА смужка з антигенним покриттям готова до додавання зразків*

    Примітка

    ВАЖЛИВО: Перед додаванням зразків змішайте розчини, перевернувши трубочки. Не забувайте міняти наконечники піпеток між кожним розчином.

    фото руки за допомогою маркера, щоб позначити одну сторону колодязної смуги, щоб зберегти його орієнтацію.
    Малюнок 3. Розмітка для орієнтації смуги колодязя
    1. Позначте одну сторону смужки лабораторним маркером, щоб вона була орієнтована під час процедури.
    2. Додайте 100-мкл позитивного контролю (ЗЕЛЕНА трубка) до свердловин 1 & 2.
    3. Додайте 100-мкл негативного контролю (ЖОВТА трубка) до свердловин 3 та 4.
    4. Додайте 100-мкл сироватки крові пацієнта А (РОЖЕВА трубка) до лунок 5 та 6.
    5. Додайте 100-мкл сироватки крові пацієнта B (синя трубка) до лунок 7 та 8.
    6. Дайте посидіти не менше 5 хвилин.
    7. Спорожніть вміст 8-луночної смужки, перевертаючи догори дном і гортаючи, поки з смужки не вийде більше рідини. Акуратно промокніть на паперовому рушнику, щоб видалити залишки рідини.
    8. Вимийте. Заповніть свердловини до верху буфером ПБС. Спорожніть вміст, як зазначено вище.
    9. Повторіть цей крок прання ще 3 рази.
    фото людини, що миє колодязі пляшкою з бризком над раковиною.
    Малюнок 4. промивання колодязів

    Крок 4: Додайте вторинне антитіло

    1. Додайте 100-мкл вторинного антитіла (CLEAR tube) до всіх лунок. Дайте посидіти 5 хвилин.
    2. Спорожніть вміст 8-луночної смужки, перевертаючи догори дном і гортаючи, поки з смужки не вийде більше рідини. Промокніть на паперовому рушнику перед пранням.
    3. Вимийте. Заповніть свердловини до верху буфером. Спорожніть смужку і промокніть на паперових рушниках.
    4. Повторіть цей крок прання ще 3 рази.

    Крок 5: Виявлення наявності реакції антиген-антитіла

    1. Додайте 100-мкл субстрату (AMBER Tube) до всіх свердловин. Через кілька хвилин деякі лунки можуть почати змінювати колір. Зміна кольору на синій вказує на наявність комплексу антиген-антитіло. Чим більше антитіл пов'язане з антигеном, тим синім буде розчин.
    2. Заповніть присутність кольору на діаграмі нижче і дайте відповідь на питання на сторінці результатів.
    фото 2 колодязів з синім кольором і двох лунок без кольору
    Малюнок 5. Позитивні колодязі (різні відтінки синього) і негативні колодязі (без кольору)

    Результати

    Використовуючи наступну колірну клавішу, запишіть свої результати в таблицю нижче:

    0 = без кольору + = дуже світло-блакитний ++ = світло-блакитний +++ = темно-синій

    Таблиця даних 1. Наявність комплексу антиген-антитіла

    Колодязь #

    1

    2

    3

    4

    5

    6

    7

    8

    Зразок Додано

    Колір

    Аналіз даних

    1. Ваш позитивний контроль демонстрував зміну кольору? Якщо ні, то як це могло статися?
    2. Ваш негативний контроль залишався чітким? Якщо ні, то як це могло статися?
    3. Порівняйте пацієнта А з позитивним і негативним контролем. Що можна зробити висновок про стан пацієнта А?
    4. Порівняйте пацієнта В з позитивним і негативним контролем. Що можна зробити висновок про стан пацієнта В?

    Навчальні питання

    1. Опишіть аналіз ІФА.
    2. Намалюйте позитивний контроль добре після кроку 2.
    3. Намалюйте та позначте діаграму позитивного контролю добре в кінці процедури. Якого кольору продукт?
    4. Намалюйте негативний контроль добре в кінці процедури.

    Атрибуція

    Адаптовано з лабораторії 17 ELISA Сандра Слівка, доктор філософії, Південний Каліфорнійський біотехнологічний центр, Коледж Сан-Дієго Мірамар, Каліфорнія. Ліцензований CC-BY-NC-SA 4.0