Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

1.18: Послідовні розведення та стандартні криві за допомогою зчитувачів мікропланшетів

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    6235

    • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

    Цілі навчання

    Цілі:

    • Виконайте кілька послідовних розведень.
    • Використовуйте спектрофотометрію для вимірювання поглинання розчинів.
    Результати навчання студентів:

    Після закінчення цієї лабораторії студенти зможуть:

    • Створіть серію розчинів зменшення концентрацій за допомогою серійних розведень.
    • Виміряйте поглинання розчинів за допомогою зчитувача мікропланшетів.
    • Створіть стандартні криві в Excel.
    • Оцініть якість стандартних кривих по їх значенню R2.

    Частина I: Послідовні розведення

    Вступ

    Послідовне розведення - це серія розведень, зроблених послідовно, використовуючи один і той же коефіцієнт розведення для кожного етапу. Коефіцієнт концентрації - це початковий об'єм, розділений на кінцевий об'єм розчину; коефіцієнт розведення буде зворотним коефіцієнту концентрації. Наприклад, якщо ви берете 1 частину проби і додаєте 9 частин води (розчинника), то ви зробили розведення 1:10; це 1/10 (0,1) концентрації вихідного розчину і має коефіцієнт розведення 10. Ці серійні розведення часто використовуються для визначення приблизної концентрації ферменту (або молекули) для кількісного визначення в аналізі. Серійні розведення дозволяють розводити невеликі аліквоти замість того, щоб витрачати велику кількість матеріалів, є економічно вигідними та прості в приготуванні.

    Рівняння 1

    \[\text{concentration factor}= \dfrac{\text{volume}_{\text{initial}}}{\text{volume}_{\text{final}}}\nonumber\]

    \[\text{dilution factor}= \dfrac{1}{\text{concentration factor}}\nonumber\]

    ілюстрація серійного розведення серії. 4 пробірки з маркуванням зразка, 1:10, 1:100, 1:1000 зі стрілками, що вказують 1 мл, що вказують від однієї трубки до наступної пробірки.
    Малюнок 1. Десятикратне серійне розведення, яке також можна назвати розведенням 1:10, або серією з коефіцієнтом розведення 10. Щоб визначити концентрацію на кожному кроці ряду, ви ділите попередню концентрацію на коефіцієнт розведення. *Розведення пробірки починають з 9-мл. Додають 1-мл і перемішують, потім 1-мл переносять в наступну пробірку. Кінцевий обсяг в останньому тюбику становив би 10-мл.

    Діаграма послідовних розлучень 1:2

    У своєму блокноті намалюйте схему, яка показує послідовні розведення для готуваних розчинів 6 кМ№ 4. На схемі вказують обсяг, що виводиться з концентрованого розчину, обсяг доданої води, концентрацію нового розчину і загальний обсяг.

    Практика розрахунків

    Проблема 1. Припустимо, що оригінальний зразок, використаний на малюнку 1, містив 400 г/л реагенту X.

    1. Тоді перша трубка для розведення 1:10 матиме концентрацію 400/10 = __________
    2. Тоді друге розведення 1:10 матиме концентрацію ____________

    Проблема 2. Припустимо, що початковий зразок, використаний на малюнку, вважається 100% концентрацією.

    1. Тоді перша трубка для розведення 1:10 матиме концентрацію _____%.
    2. Друга трубка для розведення 1:10 мала б концентрацію _____%.

    Проблема 3. Щоб зробити серійне розведення з коефіцієнтом розведення 5, потрібно буде додати 1 частину реагенту плюс ___ частин води, щоб в цілому вийшло 5 частин. Це п'ятикратне серійне розведення матиме концентрації 100%, ______% у першій розведеній трубці, _____% у другій розведеній трубці, ________% у третій розведеній трубці.

    Проблема 4. Припустимо, третя розведена пробірка дворазового серійного розведення має концентрацію 300 г/л.

    1. Це означає, що друга розведена трубка має концентрацію _________
    2. Перша розведена пробірка має концентрацію ________
    3. Оригінальна трубка має концентрацію _______
    4. Яку формулу ви могли б використати для обчислення концентрації вихідної трубки з постановки проблеми?

    Частина 1: Виготовлення серійних розлучень

    Матеріали

    Реагенти

    • Синій харчовий барвник
    • Д. Н 2 О
    • 96 колодязний мікропланшет (сухий)

    Витратні матеріали

    • Мікропіпетка P200
    • Коробка з наконечниками P200 Pipet
    Примітка

    Використовуйте один наконечник піпета для кожного серійного розведення.

    Порядок дій

    Підготовка дворазового серійного розведення (коефіцієнт розведення двох)

    1. Отримайте чисту, суху мікропластину 96 добре, завжди торкаючись лише країв. Використовуйте сухий чистий паперовий рушник, щоб витерти всі відбитки пальців на дні тарілки.
    2. Тримайте пластину до світла і перевірте, чи немає брудних плям на трьох рядах, які ви будете використовувати.
    3. (Необов'язково) Ви можете сканувати пластину без рідини, щоб дізнатися базове поглинання пластику.
    4. Піпет 100 мкл ді-води в перші 5 свердловин ряду А (A1-A5).
    5. Pipet 100 мкл вихідного синього барвника в першу лунку (A1). Обережно піпет вгору і вниз двічі перемішати.
    6. Міняти наконечник піпета не потрібно. Але переконайтеся, що ви випустили всю рідину в перший колодязь.
    7. Перенесіть 100 мкл суміші в наступну лунку (А2). Ретельно перемішати і випустити всю рідину.
    8. Перенесіть 100 мкл суміші в наступну лунку (А3). Ретельно перемішати і випустити всю рідину.
    9. Перенесіть 100 мкл суміші в наступну лунку (А4). Ретельно перемішати і випустити всю рідину.
    10. Перенесіть 100 мкл суміші в наступну лунку (А5). Ретельно перемішати і випустити всю рідину.
    11. Перенесіть 100 мкл суміші в наступну лунку (А6). Зробіть фото колодязів поверх білого паперу.

    Підготовка чотириразового серійного розведення (коефіцієнт розведення чотирьох)

    1. Використовуючи новий наконечник піпету, піпет 150 мкл ді-води в перші 5 лунок ряду B (B1-B5).
    2. Міняти наконечник піпета не потрібно. Піпет 50 мкл вихідного синього барвника в першу лунку (B1). Обережно піпет вгору і вниз двічі перемішати. Потім переконайтеся, що ви випустили всю рідину в першу лунку.
    3. Перенесіть 50 мкл суміші в наступну лунку (В2). Ретельно перемішати і випустити всю рідину.
    4. Перенесіть 50 мкл суміші в наступну лунку (В3). Ретельно перемішати і випустити всю рідину.
    5. Перенесіть 50 мкл суміші в наступну лунку (В4). Ретельно перемішати і випустити всю рідину.
    6. Перенесіть 50 мкл суміші в наступну лунку (В5). Ретельно перемішати і випустити всю рідину.
    7. Перенесіть 50 мкл суміші в наступну лунку (В6). Це гарантує, що всі свердловини В1-В5 мають однаковий обсяг.
    8. Зробіть фото колодязів поверх білого паперу.

    Підготовка п'ятикратного серійного розведення (коефіцієнт розведення п'яти)

    1. Використовуючи новий наконечник піпету, піпет 160 мкл DI-води в перші 5 лунок ряду C (C1-C5).
    2. Міняти наконечник піпета не потрібно. Піпет 40 мкл вихідного синього барвника в першу лунку (C1). Обережно піпет вгору і вниз двічі перемішати. Потім переконайтеся, що ви випустили всю рідину в першу лунку.
    3. Перенесіть 40 мкл суміші в наступну лунку (С2). Ретельно перемішати і випустити всю рідину.
    4. Перенесіть 40 мкл суміші в наступну лунку (С3). Ретельно перемішати і випустити всю рідину.
    5. Перенесіть 40 мкл суміші в наступну лунку (С4). Ретельно перемішати і випустити всю рідину.
    6. Перенесіть 40 мкл суміші в наступну лунку (С5). Ретельно перемішати і випустити всю рідину.
    7. Перенесіть 40 мкл суміші в наступну лунку (С6). Це гарантує, що всі свердловини С1-С5 мають однаковий обсяг.
    8. Зробіть фото колодязів поверх білого паперу.
    фото прозорий пластиковий лоток з колодязями і крупним планом деяких свердловин, заповнених синьою рідиною різних відтінків.
    Малюнок 2: Мікропластинчасті і серійні розведення.

    Частина II: Вимірювання поглинання

    Мікропланшетний зчитувач - це спектрофотометричний прилад, який може одночасно вимірювати поглинання 96 різних зразків. Чи економить це час у порівнянні з роботою з окремими кюветами та спектрофотометром? Ми будемо використовувати мікропланшет з 96 лунками, щоб ви могли виконати всі ваші серійні розведення на одній пластині і сканувати всю пластину за допомогою зчитувача мікропланшетів один раз. Мікропланшет має рядки з позначкою A-H та стовпчики з позначкою #1 -12. Використовуючи синій барвник, ви зробите серійне розведення 1:2 на рядку A, зробите серійне розведення 1:4 на рядку B та серійне розведення 1:5 на рядку C.

    Матеріали:

    • Обладнання
    • Мікропланшетний зчитувач і кабелі
    • Портативний комп'ютер з програмою, встановленою для запуску microplate reader

    Порядок дій:

    1. Приєднайте кабель від портативного комп'ютера до зчитувача мікропланшетів.
    2. Живлення «ON» портативного комп'ютера і зчитувача мікропланшетів.
    3. Відкрийте комп'ютерну програму для запуску зчитувача мікропланшетів.
    4. Натисніть кнопку, щоб відкрити зчитувач мікропланшетів і виставити платформу завантаження мікропланшетів.
    5. Надійно помістіть мікропланшет у область тримача, переконавшись, що добре A1 знаходиться у верхньому лівому куті.
    6. Натискаємо кнопку, щоб закрити зчитувач мікропланшетів.
    7. На комп'ютерній програмі почніть «читати нову пластину», використовуючи довжину хвилі 595 нм (для синього барвника).
    8. Комп'ютерною мишею виділіть осередки, відповідні криниці мікропланшетів, якими ви користувалися. Сфотографуйте екран комп'ютера і зверніть увагу на дані про поглинання в таблицях нижче.
    9. Розрахуйте концентрацію барвника для кожної лунки, розділивши коефіцієнт розведення для кожного етапу серійного розведення. Оригінальний барвник - 100% концентрація.
    Таблиця даних 1. Вимірювання поглинання дворазового послідовного розведення за допомогою зчитувача мікропланшетів

    Колодязь

    А1

    А2

    А3

    А4

    А5

    Поглинання @ 595 нм

    		          

    Концентрація барвника

    		          
    Таблиця даних 2. Вимірювання поглинання чотириразового послідовного розведення за допомогою зчитувача мікропланшетів

    Колодязь

    А1

    А2

    А3

    А4

    А5

    Поглинання @ 595 нм

    		          

    Концентрація барвника

    		          
    Таблиця даних 3. Вимірювання поглинання п'ятикратного послідовного розведення за допомогою зчитувача мікропланшетів

    Колодязь

    А1

    А2

    А3

    А4

    А5

    Поглинання @ 595 нм

    		          

    Концентрація барвника

    		          

    Частина III: Стандартні криві

    Вступ

    Стандартні криві (також відомі як калібрувальні криві) показують взаємозв'язок між двома величинами. Стандартні криві найчастіше використовуються для визначення концентрації «невідомих» зразків шляхом порівняння їх з еталонними зразками з «відомими» концентраціями. Пізніше в курсі ми будемо використовувати стандартні криві для вимірювання кількості витягнутого білка і визначення розміру молекул ДНК. У сучасній лабораторії ви зробили три серійні розведення і повинні мати можливість розрахувати концентрації для кожного розведення. Використовуючи Excel, ви підготуєте стандартні криві для кожного послідовного розведення та визначите, чи є ваша стандартна крива точною. Потім ви визначите концентрацію невідомих зразків, використовуючи ваші стандартні криві.

    Цей розсіювач п'ятикратної стандартної кривої послідовного розведення показує абсолютно позитивну залежність, оскільки діагональний графік лінії починається з 0 внизу ліворуч і збільшується пропорційно верхньому правому куті.
    Малюнок 3: Стандартна крива п'ятикратного серійного розведення

    Значення R-квадрата (R2) - коефіцієнт кореляції або квадрат кореляції. Для стандартної кривої це значення вимірює, наскільки сильна лінійна залежність між концентрацією реагенту (вісь X) та значенням поглинання (вісь Y). Якщо значення R2 = 1, то це показує ідеальну позитивну залежність. Оскільки ваші стандартні криві генеруються з послідовних розведень, які ви піпетками, значення R2 також можуть показати, наскільки точними є ваші навички піпетування.

    Діяльність A: Створення стандартної кривої для кожного послідовного розведення

    1. Введіть дані в Excel.
    2. Виділіть значення даних за допомогою миші. На вкладці «Вставка» натисніть на значок Scatter і виберіть у спадному меню пункт Скаттер з прямими лініями та маркерами, щоб створити стандартну криву.
    3. Обов'язково додайте заголовок графіка та мітки для осей X та Y.
    4. Щоб додати лінію тренду до графіка, клацніть правою кнопкою миші на стандартній лінії кривої на діаграмі, щоб відобразити спливаюче меню дій, пов'язаних з графіком. Виберіть «Додати лінію тренду» з цього меню.
    5. Виберіть «відобразити рівняння на графіку» та «відобразити значення R-квадрата на графіку». В ідеалі значення R2 повинно бути більше 0,99.
    6. Роздрукуйте стандартні криві і додайте в блокнот.

    Діяльність Б: Визначення концентрації «невідомих» зразків

    1. У вашого інструктора буде кілька невідомих зразків.
    2. Визначте значення поглинання кожного зразка.
    3. На стандартній кривій використовуйте рівняння графіка для вирішення відповідної концентрації цих зразків. Або оцінювати з лінійного графіка.
    Таблиця даних 4. Концентрація порівняно з графіками послідовного розведення
    Невідомий зразок Поглинання 2-кратний 4-кратний 5-кратний
             
             
             
             

    Навчальні питання

    1. Використовуючи серійне розведення, опишіть, як ви готували б 10 мл 1,0%, 0,1% і 0,01% розчинів NaOH. Запасний розчин - 10% NaOH. Намалюйте діаграми як частину описів/протоколів.
    2. За допомогою зображеної стандартної кривої обчислити концентрацію невідомого розчину, якщо значення його поглинання дорівнює 0,55.
    3. Оцініть якість стандартної кривої (див. Діаграму) за допомогою значення R2.
    Графік з віссю x як концентрацією Cu2+ та віссю y як поглинання. Точки даних вирівнюються вздовж висхідної лінії графіка.
    Малюнок 4. Стандартна крива поглинання міді II