15.2: Очищення білка (активність)

$\newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} }$

$\newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}}$

$\newcommand{\id}{\mathrm{id}}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}$

$\newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}$

$\newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}$

$\newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}$

$\newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}$

$\newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}$

$\newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\id}{\mathrm{id}}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

$\newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}$

$\newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}$

$\newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}$

$\newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}$

$\newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}$

$\newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}$

$\newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}$

$\newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

Виключення розміру молекул барвника

В якості демонстрації інструктор може проілюструвати концепцію виключення розміру на наборі змішаних харчових барвників.

Виключення за розмірами хроматографії харчового барвника.

Нехай колонка порожня над склянкою.
Обережно завантажте на колонку 0,2 мл харчової барвникової суміші.
Помістіть 10 трубок на стійку під колону.
Помістіть на колонку буфер об'ємом 1 мл і зберіть фракції 0,5 мл.
Продовжуйте додавати буфер по 1 мл за раз, поки не будуть зібрані всі фракції.

Виключення за розмірами білків

Ця вправа спрямована на очищення зеленого флуоресцентного білка (GFP) або блакитного флуоресцентного білка (BFP) від бактеріального лізату. Ці білки мають специфічний розмір 238 амінокислот і становлять 40 000 дальтон (40кД). Виходячи з їх конкретного розміру, вони матимуть певну швидкість міграції через смолу для виключення розміру. Пам'ятайте, що бактеріальний лізат сповнений додаткових білків, які не є вашим цікавим білком, який ми намагаємося ізолювати.

3D-модель GFP (вгорі зліва), BFP (вгорі праворуч), структурне вирівнювання GFP та BFP (по центру) та вирівнювання послідовності (знизу) ілюструючи 3 зміни амінокислот для отримання альтернативного білка. Червоні зірочки вказують на місце мутацій.

Краплі рідини будуть збиратися фракціями. Фракції, що містять флуоресцентні білки, будуть знаходитися тільки в конкретних фракціях, які будуть видні при УФ-освітленні.

Вертикально монтуємо колону на кільцевій підставці. Переконайтеся, що вона пряма.
Накиньте ковпачок на носик в нижній частині колони.
Ретельно перемішайте суспензію (молекулярне сито), закручуючи або обережно перемішуючи.
Акуратно піпсуйте 2 мл змішаної суспензії в колонку, давши їй текти вниз по внутрішніх стінках колони.
Помістіть порожню склянку під колону, щоб зібрати промивний буфер.
Зніміть ковпачок з нижньої частини колони і дайте матриці упакувати в колонку.
Етикетка вісім мікроцентрифуг пробірки #1 -8.
Повільно завантажуйте колонку 0,2 мл екстракту GFP. Дозвольте витяжці повністю увійти в колонку.
Додайте 1 мл буфера елюції поверх смоли, не порушуючи смолу.

Додайте буфер повільно (кілька крапель за раз), щоб уникнути розведення зразка білка.
Використовуючи градуйовані мітки з боків пробирок, зберіть фракції 0,5 мл в маркованих мікроцентрифужних пробірках.
Продовжуйте додавати буфер 1 мл і збирати фракції, поки всі пробірки не заповниться.

Перевірте всі фракції за допомогою довгохвильового ультрафіолетового світла, щоб ідентифікувати трубки, які містять флуоресцентні білки GFP або BFP.
Подальша очистка може проводитися за допомогою іншої смоли з кількома фракціями, що містять цікавить білок.
Протеїнові зразки повинні бути запущені на акриламідному гелі і забарвлені проти всіх білків, щоб перевірити чистоту зразка або вимірювань флуоресценції, зроблених.