Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

15.1: Вступ

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    6496

    • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

    Білкова експресія

    Рекомбінантна технологія ДНК має багато застосувань в фундаментальних наукових дослідженнях, щоб краще зрозуміти природу живих істот. Як інструмент, рекомбінантна технологія ДНК може бути використана для експресії білків до медичних застосувань. До біотехнології цукровий діабет I типу (інсулінозалежний) лікувався шляхом ін'єкції інсуліну, виділеного з підшлункової залози свиней. Завдяки здатності експресувати людські білки всередині бактерій, дріжджів та інших клітин, жертвувати свиней за свинячий інсулін більше не потрібно.

    Бактеріальний вектор експресії PGex-3x містить ген AMPR, походження реплікації, MCS нижче за течією гібридного промотора lac/trp (tac) та послідовність кодування глутатіон-S-трансферази (GST). GST діє як тег, який зливається безпосередньо з білком з цікавить гена і використовується для очищення білка за допомогою смоли глутатіону.

    Бактерії або інші клітини можуть бути розроблені для експресії білків через процес клонування та трансформації. Бактерії вигідні завдяки швидкому життєвому циклу і легкості зростання. Вектор експресії бактерій містить основні плазмідні ознаки: походження реплікації, а також ген антибіотикорезистентності. Часто тег спорідненості буде використовуватися, щоб допомогти в очищенні білка. Приклад у векторі вище показує тег GST (глутатіон-s-трансферази), який можна очистити глутатіоновою смолою. Експресія є лише першою проблемою, оскільки бактерії також синтезують білки, необхідні для росту та ділення бактерій. Ін'єкція цих білків на додаток до інсуліну спричинить імунну реакцію, яка може бути смертельною. Тому потрібно, щоб перетримані білки були очищені і виділені з інших небажаних білків.

    Файл: e.-Колі зростання.gif

    Кредит: Стюарт Е.Дж., Медден Р., Пол Г., Таддей Ф (CC-SA 3.0).

    Критерії вибору системи вираження

    Системи експресії білка мають властиві переваги і недоліки. Наведена вище таблиця узагальнює порівняння різних клітинних систем виробництва (Fernandez & Hoeffler, 1999).

    Очищення

    В залежності від властивостей білка можуть застосовуватися різні способи виділення. Іонообмінна хроматографія корисна, якщо цікавить білок має специфічний заряд, який буде взаємодіяти зі смолою, упакованої з протилежним зарядом.

    Імуноосадження

    Імуноопадів: Колонка упакована білком-А агарозою, яка зв'язується з антитілами. Клітинні лізати потім завантажуються на колони, де вони протікають, і їм дозволяється взаємодіяти з антитілом. Промивання виконуються для видалення неспецифічно зв'язаних білків. Буфер елюції використовується для порушення взаємодії антитіла з білковою мішенню.

    Очищення спорідненості

    Очищення афінності використовує використання специфічних антитіл, які дуже щільно зв'язуються з цікавим білком, щоб утримувати його на стовпі. За допомогою цих прийомів білок, що зберігається на смолі, багато разів промивають, щоб видалити інші білки, які не спеціально прилипають. Зміна рН або іонних умов потім використовується, щоб порушити взаємодію зі смолою і елітувати білки з колони. Білки, які розроблені для того, щоб містити мітки, можуть бути очищені антитілами, специфічними для цих міток. Крім того, додавання 6 або більше послідовних залишків гістидину до кінця білка робить їх сприйнятливими до очищення нікель-NTA смолою або очищенням кобальту. У цих випадках тег 6xHis асоціюється з цими іонами металів на смолі вибірково дотримуються.

    Нікель NTA протеїн Ціна

    Нікелева смола NTA, координуючи захоплення білка з позначкою 6His.

    Виключення розміру

    Файл: Активовано Charcoal.jpg

    Кредит: Мідріатичний (CC-BY-SA 3.0)

    Розмір файлу: exchrom.png

    Кредит: Такометр (CC-BY 2.5)

    Більшість з вас знайомі з фільтрами очищення води. Перш ніж використовувати ці фільтри, ви замочуєте їх у воді, і темні залишки витікають назовні. Цей темний залишок - активоване вугілля. Активоване вугілля має крихітні мікроскопічні пори, які затримують дрібні предмети, такі як іони та інші частинки. Основною метою цих фільтрів є видалення металів і хлору, які містяться у водопровідній воді. Пориста природа активованого вугілля робить його корисним для уловлювання молекул в системах очищення води.

    Процес, який використовується для уловлювання цих дрібних частинок, називається виключенням розміру. На відміну від електрофорезу агарозного гелю, де більш дрібні частинки швидше переміщаються по матриці, смоли для виключення розміру затримують менші молекули.

    Файл: Пори розмір schematic.jpg

    Чим менше молекула, тим довше вони проводять всередині пір, коли вони проходять через матрицю.

    Значення очищення

    Файл: Поліфемний (aq.) .jpg

    Кредит: Ханс Хілл Еверт (CC-BY)

    Всі ін'єкційні препарати повинні бути очищеними від ендотоксинів від бактерій. Очищення білка, що цікавить, від бактеріальних лізатів видаляє небезпечні патогенні матеріали, які в іншому випадку активували б імунну реакцію господаря.

    Краб-підкова (Limulus polyphemus) виконує особливу функцію в екосистемі, забезпечуючи яйцями для харчування перелітних птахів. Цей організм також містить особливий тип клітин у своїй гемолімфі. Тест лізату амебоцитів Limulus (LAL) є найбільш чутливим аналізом виявлення ендотоксинів з бактерій. Амебоцити збираються з цих організмів для використання на тестуванні партій ін'єкційних препаратів для забезпечення належного очищення та безпеки.

    Посилання