7.5: Використання біохімії для ідентифікації мікроорганізмів

Цілі навчання

• Опишіть приклади продуктів біосинтезу всередині клітини, які можуть бути виявлені для ідентифікації бактерій

Точна ідентифікація бактеріальних ізолятів має важливе значення в клінічній мікробіологічній лабораторії, оскільки результати часто інформують рішення про лікування, які безпосередньо впливають на результати пацієнта. Наприклад, випадки харчового отруєння вимагають точної ідентифікації збудника, щоб медики могли призначити відповідне лікування. Так само важливо точно визначити збудника збудника під час спалаху захворювання, щоб можна було використовувати відповідні стратегії для стримування епідемії.

Існує безліч способів виявлення, характеристики та ідентифікації мікроорганізмів. Деякі методи спираються на фенотипічні біохімічні характеристики, а інші використовують генотипічну ідентифікацію. Біохімічні характеристики бактерії забезпечують багато ознак, які корисні для класифікації та ідентифікації. Аналіз поживних і метаболічних можливостей бактеріального ізоляту є загальним підходом для визначення роду і виду бактерії. Деякі з найважливіших метаболічних шляхів, які бактерії використовують для виживання, будуть розглянуті в Мікробний метаболізм. У цьому розділі ми обговоримо кілька методів, які використовують біохімічні характеристики для ідентифікації мікроорганізмів.

Деякі мікроорганізми зберігають певні сполуки у вигляді гранул у своїй цитоплазмі, і вміст цих гранул може бути використаний для ідентифікації. Наприклад, полі-β-гідроксибутират (PHB) - це сполука, що накопичує вуглець та енергію, що міститься в деяких нетлуоресцентних бактеріях роду Pseudomonas. Різні види в межах цього роду можна класифікувати за наявністю або відсутністю PHB та флуоресцентних пігментів. Збудник людини P. aeruginosa та збудник рослин P. syringae є двома прикладами флуоресцентних видів P. aeruginosa, які не накопичують гранули PHB.

Інші системи покладаються на біохімічні характеристики для ідентифікації мікроорганізмів за їх біохімічними реакціями, такими як утилізація вуглецю та інші метаболічні тести. У невеликих лабораторних умовах або в навчальних лабораторіях ці аналізи проводяться за допомогою обмеженої кількості пробірки. Однак більш сучасні системи, такі як розроблена Biolog, Inc., засновані на панелах біохімічних реакцій, що виконуються одночасно і аналізуються програмним забезпеченням. Система Biolog ідентифікує клітини на основі їх здатності метаболізувати певні біохімічні речовини та за їх фізіологічними властивостями, включаючи рН та хімічну чутливість. Він використовує всі основні класи біохімікатів у своєму аналізі. Ідентифікація може виконуватися вручну або за допомогою напівавтоматичних або повністю автоматизованих приладів.

Інша автоматизована система ідентифікує мікроорганізми, визначаючи масовий спектр зразка, а потім порівнюючи його з базою даних, яка містить відомі масові спектри для тисяч мікроорганізмів. Цей метод заснований на матричній лазерній десорбції/іонізації під час польоту мас-спектрометрії (MALDI-TOF) і використовує одноразові пластини MALDI, на яких мікроорганізм змішується зі спеціалізованим матричним реагентом (рис.\(\PageIndex{1}\)). Суміш зразка/реагентів опромінюється високоінтенсивним імпульсним ультрафіолетовим лазером, що призводить до викиду газоподібних іонів, що утворюються з різних хімічних складових мікроорганізму. Ці газоподібні іони збираються та прискорюються через мас-спектрометр, при цьому іони рухаються зі швидкістю, визначеною їх співвідношенням маси до заряду (м/з), таким чином, досягаючи детектора в різний час. Ділянка сигналу детектора проти m/z дає масовий спектр для організму, який однозначно пов'язаний з його біохімічним складом. Порівняння масового спектру з бібліотекою еталонних спектрів, отриманих з ідентичних аналізів відомих мікроорганізмів, дозволяє ідентифікувати невідомий мікроба.

Малюнок\(\PageIndex{1}\): Методи MALDI-TOF в даний час зазвичай використовуються для діагностичних процедур в клінічних мікробіологічних лабораторіях. Ця технологія здатна швидко ідентифікувати деякі мікроорганізми, які не можуть бути легко ідентифіковані більш традиційними методами. (Кредит «MALDI plate photo»: модифікація роботи Чень Q, Лю Т, Чень Г; кредитні «графіки»: модифікація роботи Бейлеса Дж., Відаля Л, Іванова Д.А., Соловйова М.)

Мікроби також можуть бути ідентифіковані шляхом вимірювання їх унікальних ліпідних профілів. Як ми дізналися, жирні кислоти ліпідів можуть відрізнятися довжиною ланцюга, наявністю або відсутністю подвійних зв'язків, а також кількістю подвійних зв'язків, гідроксильних груп, гілок і кілець. Для ідентифікації мікроба за його ліпідним складом аналізуються жирні кислоти, присутні в їх мембранах. Загальний біохімічний аналіз, який використовується для цієї мети, - це методика, яка використовується в клінічних, громадських та харчових лабораторіях. Він спирається на виявлення унікальних відмінностей у жирних кислотах і називається аналізом метилового ефіру жирних кислот (FAME). В аналізі FAME жирні кислоти витягуються з мембран мікроорганізмів, хімічно змінені з утворенням летючих метилових ефірів, і аналізуються за допомогою газової хроматографії (ГК). Отримана хроматограма ГК порівнюється з еталонними хроматограмами в базі даних, що містить дані для тисяч бактеріальних ізолятів для ідентифікації невідомого мікроорганізму (рис.\(\PageIndex{2}\)).

Малюнок\(\PageIndex{2}\): Аналіз метилового ефіру жирних кислот (FAME) при ідентифікації бактерій призводить до хроматограми, унікальної для кожної бактерії. Кожному піку в газовій хроматограмі відповідає конкретний метиловий ефір жирної кислоти і його висота пропорційна кількості, присутній в клітці. (Кредит «культура»: модифікація роботи Центрів контролю та профілактики захворювань; кредитний «графік»: модифікація роботи Чжан П. та Лю П.)

Пов'язаний метод ідентифікації мікроорганізмів називається аналізом жирних кислот, отриманих фосфоліпідів (PLFA). Мембрани в основному складаються з фосфоліпідів, які можуть бути омилені (гідролізовані лугом) для виділення жирних кислот. Отримана суміш жирних кислот потім піддається аналізу FAME, а виміряні ліпідні профілі можна порівняти з профілями відомих мікроорганізмів для ідентифікації невідомого мікроорганізму.

Бактеріальна ідентифікація також може базуватися на білках, що виробляються в конкретних умовах росту в організмі людини. Ці види процедур ідентифікації називаються протеомним аналізом. Для проведення протеомного аналізу білки від збудника спочатку відокремлюються рідинною хроматографією високого тиску (ВЕРХ), а зібрані фракції потім перетравлюються з отриманням менших пептидних фрагментів. Ці пептиди ідентифікуються за допомогою мас-спектрометрії та порівнюються з пептидами відомих мікроорганізмів для ідентифікації невідомого мікроорганізму у вихідному зразку.

Мікроорганізми також можуть бути ідентифіковані за вуглеводами, прикріпленими до білків (глікопротеїнів) в плазматичній мембрані або клітинній стінці. Антитіла та інші білки, що зв'язують вуглеводи, можуть приєднуватися до специфічних вуглеводів на клітинних поверхнях, змушуючи клітини згущуватися. Серологічні тести (наприклад, тести груп Лансфілда, які використовуються для ідентифікації видів Streptococcus) проводяться для виявлення унікальних вуглеводів, розташованих на поверхні клітини.

Клінічна спрямованість: Дозвіл

Пенні перестала використовувати свій новий сонцезахисний крем і застосувала кортикостероїдний крем до висипу за вказівкою. Однак через кілька днів її висип не покращився і насправді, здавалося, погіршувався. Вона зробила подальшу зустріч зі своїм лікарем, який спостерігав нерівну червону висип і наповнені гноєм пухирі навколо волосяних фолікулів (рис.\(\PageIndex{3}\)). Висип особливо концентрувалася на ділянках, які були б покриті купальником. Після деякого допиту Пенні сказала лікареві, що вона нещодавно відвідала вечірку біля басейну і провела деякий час у гарячій ванні. У світлі цієї нової інформації лікар запідозрив випадок висипу у гарячій ванні, інфекції, часто спричиненої бактерією Pseudomonas aeruginosa, опортуністичним збудником, який може процвітати в гарячих ванн та басейнів, особливо коли вода недостатньо хлорована. P. aeruginosa - це та сама бактерія, яка пов'язана з інфекціями в легенях хворих на муковісцидоз.

Малюнок\(\PageIndex{3}\): Вплив синьогнійної палички у воді басейну або гарячої ванни іноді може спричинити шкірну інфекцію, яка проявляється як «висип у гарячій ванні». (кредит: модифікація роботи «Lsupellmel» /Wikimedia Commons)

Лікар зібрав зразок висипу Пенні для відправки в лабораторію клінічної мікробіології. Були проведені підтверджуючі тести, щоб відрізнити P. aeruginosa від кишкових збудників, які також можуть бути присутніми у воді басейну та гарячої ванни. Тест включав вироблення синьо-зеленого пігменту піоціаніна на цетримідному агарі і зростання при 42 °С Цетримід є селективним агентом, який пригнічує ріст інших видів мікробної флори, а також підсилює вироблення пігментів P. aeruginosa пігментів піоцианіна і флуоресцеїну, які є характерні синьо-зелений і жовто-зелений відповідно.

Тести підтвердили наявність P. aeruginosa в зразку шкіри Пенні, але лікар вирішив не призначати антибіотик. Незважаючи на те, що P. aeruginosa є бактерією, види Pseudomonas, як правило, стійкі до багатьох антибіотиків. На щастя, шкірні інфекції, такі як Пенні, зазвичай самообмежуються; висип зазвичай триває близько 2 тижнів і розсмоктується самостійно, з медикаментозним лікуванням або без нього. Лікар порадив Пенні почекати його і продовжувати використовувати кортикостероїдний крем. Крем не вб'є P. aeruginosa на шкірі Пенні, але він повинен заспокоїти її висип і мінімізувати свербіж, пригнічуючи запальну реакцію її організму на бактерії.

Ключові поняття та резюме

• Точна ідентифікація бактерій має важливе значення в клінічній лабораторії для діагностики та лікування епідемій, пандемій та харчових отруєнь, спричинених бактеріальними спалахами.
• Фенотипічна ідентифікація мікроорганізмів передбачає використання спостережуваних ознак, включаючи профілі структурних компонентів, таких як ліпіди, біосинтетичні продукти, такі як цукру або амінокислоти, або сполуки для зберігання, такі як полі-β-гідроксибутират.
• Невідомий мікроб може бути ідентифікований з унікального масового спектру, отриманого при його аналізі за допомогою матриці за допомогою лазерної десорбції/іонізації часу польоту мас-спектрометрії (MALDI-TOF).
• Мікроби можуть бути ідентифіковані шляхом визначення їх ліпідних композицій, використовуючи метилові ефіри жирних кислот (FAME) або аналіз жирних кислот, отриманих фосфоліпідів (PLFA).
• Протеомний аналіз, дослідження всіх накопичених білків організму, також може бути використаний для ідентифікації бактерій.
• Глікопротеїни в плазматичній мембрані або структурах клітинної стінки можуть зв'язуватися з лектинами або антитілами і можуть використовуватися для ідентифікації.