17.1C: Молекулярне та клітинне клонування

Last updated
Save as PDF

Page ID: 4635

Boundless
Boundless

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Молекулярне клонування відтворює потрібні ділянки або фрагменти генома, дозволяючи маніпулювати та вивчати гени.

Цілі навчання

Опишіть процес молекулярного клонування

Ключові моменти

Клонування дрібних фрагментів генома дозволяє вивчати окремі гени, їх білкові продукти та некодуючі області ізольовано.
Плазміда, також відома як вектор, - це невелика кругова молекула ДНК, яка реплікується незалежно від хромосомної ДНК; вона може бути використана для надання «папки», в яку можна вставити потрібний фрагмент ДНК.
Рекомбінантні молекули ДНК - це плазміди з вставленою в них чужорідною ДНК; вони створюються штучно, оскільки вони не зустрічаються в природі.
Бактерії та дріжджі природним чином виробляють клони себе, коли вони розмножуються безстатевим шляхом клітинного клонування.

Ключові умови

рекомбінантна ДНК: ДНК, яка була спроектована шляхом з'єднання фрагментів ДНК з декількох видів і введена в клітини господаря
молекулярне клонування: біологічний метод, який створює багато однакових молекул ДНК і спрямовує їх реплікацію в організмі господаря
плазміда: коло двоцепочечной ДНК, відокремлений від хромосом, який міститься в бактеріях і найпростіших

Молекулярне клонування

Взагалі, слово «клонування» означає створення досконалої репліки, однак в біології відродження цілого організму називають «репродуктивним клонуванням». Задовго до того, як були зроблені спроби клонувати цілий організм, дослідники навчилися відтворювати бажані області або фрагменти генома, процес, який називають молекулярним клонуванням.

Клонування дрібних фрагментів генома дозволяє проводити маніпуляції та дослідження конкретних генів (і їх білкових продуктів) або некодуючих областей ізольовано. Плазміда (також називається вектором) - це невелика кругова молекула ДНК, яка реплікується незалежно від хромосомної ДНК. При клонуванні молекули плазміди можуть бути використані для надання «папки», в яку можна вставити потрібний фрагмент ДНК. Плазміди зазвичай вводяться бактеріальному господареві для проліферації. У бактеріальному контексті фрагмент ДНК з генома людини (або генома іншого досліджуваного організму) називають чужорідною ДНК (або трансгеном), щоб диференціювати її від ДНК бактерії, яка називається ДНК господаря.

Плазміди зустрічаються природним шляхом у бактеріальних популяціях (таких як кишкова паличка) і мають гени, які можуть сприяти сприятливим рисам організму, таким як резистентність до антибіотиків (здатність не впливати на антибіотики). Плазміди були перероблені та розроблені як вектори для молекулярного клонування та великомасштабного виробництва важливих реагентів, таких як інсулін та гормон росту людини. Важливою особливістю плазмідних векторів є легкість, з якою чужорідний фрагмент ДНК може бути введений через сайт багаторазового клонування (MCS). MCS - це коротка послідовність ДНК, що містить кілька ділянок, які можна вирізати різними загальнодоступними рестрикційними ендонуклеазами. Рестрикційні ендонуклеази розпізнають конкретні послідовності ДНК і розрізають їх передбачуваним чином; вони природним чином виробляються бактеріями як захисний механізм проти чужорідної ДНК. Багато рестрикційні ендонуклеази роблять шахові надрізи в двох нитках ДНК, такі, що зрізані кінці мають 2- або 4-базовий одножильний звис. Оскільки ці звіси здатні відпалювати з додатковими свесами, їх називають «липкими кінцями». Додавання ферменту під назвою ДНК-лігаза постійно приєднується до фрагментів ДНК через фосфодіефірні зв'язки. Таким чином, будь-який фрагмент ДНК, утворений рестрикційним розщепленням ендонуклеази, може бути з'єднаний між двома кінцями плазмідної ДНК, яка була розрізана з однаковою рестрикцією ендонуклеази.

зображення — Малюнок\(\PageIndex{1}\): Молекулярне клонування: Ця діаграма показує кроки, що беруть участь у молекулярному клонуванні, де відтворюються регіони або фрагменти генома, щоб дозволити вивчати або маніпулювати генами та їх білковими продуктами.

Рекомбінантні молекули ДНК

Плазміди з введеними в них чужорідними ДНК називаються рекомбінантними молекулами ДНК, оскільки вони створені штучно і не зустрічаються в природі. Їх також називають химерними молекулами, оскільки походження різних частин молекул можна простежити до різних видів біологічних організмів або навіть до хімічного синтезу. Білки, які експресуються з рекомбінантних молекул ДНК, називаються рекомбінантними білками. Не всі рекомбінантні плазміди здатні експресувати гени. Рекомбінантну ДНК, можливо, доведеться перемістити в інший вектор (або господар), який краще призначений для експресії генів. Плазміди також можуть бути розроблені для експресії білків лише при стимулюванні певними факторами навколишнього середовища, щоб вчені могли контролювати експресію рекомбінантних білків.

Клітинне клонування

Одноклітинні організми, такі як бактерії та дріжджі, природним чином виробляють клони себе, коли вони розмножуються безстатевим шляхом бінарного поділу; це відомо як клітинне клонування. Ядерна ДНК дублюється процесом мітозу, що створює точну копію генетичного матеріалу.