Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

17.1B: Основні методи маніпулювання генетичним матеріалом (ДНК та РНК)

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    4694

    • Boundless
    • Boundless
    \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

    Основні методи, що використовуються при маніпуляції з генетичним матеріалом, включають екстракцію, гелевий електрофорез, ПЛР та методи блоттингу.

    Цілі навчання
    • Розрізняють серед основних методик, що застосовуються для маніпулювання ДНК і РНК

    Ключові моменти

    • Перший крок до вивчення або роботи з нуклеїновими кислотами включає виділення або вилучення ДНК або РНК з клітин.
    • Гелевий електрофорез залежить від негативно-заряджених іонів, присутніх на нуклеїнових кислотах при нейтральному або основному рН, щоб розділити молекули на основі розміру.
    • Конкретні ділянки ДНК можуть бути ампліфіковані за допомогою полімеразної ланцюгової реакції для подальшого аналізу.
    • Південний блоттинг передбачає перенесення ДНК на нейлонову мембрану, тоді як північний блоттинг - це перенесення РНК на нейлонову мембрану; ці методи дозволяють досліджувати зразки на наявність певних послідовностей.

    Ключові умови

    • денатурація: зміна складчастої структури білка (і, отже, фізичних властивостей), спричинена нагріванням, зміною рН або впливом певних хімічних речовин
    • електрофорез: метод поділу і аналізу великих молекул, таких як білки або нуклеїнові кислоти, шляхом міграції колоїдного розчину їх через гель під впливом електричного поля
    • полімеразна ланцюгова реакція: методика в молекулярній біології для створення декількох копій ДНК із зразка

    Основні методи маніпулювання генетичним матеріалом (ДНК та РНК)

    Щоб зрозуміти основні методи, що використовуються для роботи з нуклеїновими кислотами, пам'ятайте, що нуклеїнові кислоти - це макромолекули, виготовлені з нуклеотидів (цукру, фосфату та азотистої основи), пов'язаних фосфодіефірними зв'язками. Фосфатні групи на цих молекулах мають чистий негативний заряд. Весь набір молекул ДНК в ядрі називається геномом. ДНК має дві взаємодоповнюючі нитки, пов'язані водневими зв'язками між парними основами. Дві нитки можуть бути розділені під впливом високих температур (денатурація ДНК) і можуть бути відпалені охолодженням. ДНК може бути реплікована ферментом ДНК-полімерази. На відміну від ДНК, яка знаходиться в ядрі еукаріотичних клітин, молекули РНК залишають ядро. Найпоширенішим типом РНК, який аналізується, є месенджерна РНК (мРНК), оскільки вона представляє гени, що кодують білок, які активно експресуються.

    Екстракція ДНК та РНК

    Для вивчення або маніпулювання нуклеїновими кислотами ДНК або РНК спочатку повинні бути виділені або витягнуті з клітин. Це можна зробити за допомогою різних технік. Більшість методів екстракції нуклеїнових кислот передбачають кроки для розриву клітини та використання ферментативних реакцій для знищення всіх макромолекул, які не бажані (наприклад, деградація небажаних молекул та відділення від зразка ДНК). Клітини розбиваються за допомогою буфера лізису (розчину, який в основному є миючим засобом); лізис означає «розщеплюватися». Ці ферменти розщеплюють ліпідні молекули в мембранах клітини і ядра. Макромолекули інактивуються за допомогою ферментів, таких як протеази, що розщеплюють білки, і рибонуклеази (РНК), які розщеплюють РНК. Потім ДНК осаджується за допомогою спирту. Геномна ДНК людини зазвичай видно як желатинова біла маса. Зразки можуть зберігатися при -80° C протягом багатьох років.

    зображення
    Малюнок\(\PageIndex{1}\): Екстракція ДНК: Ця діаграма показує основний метод, який використовується для вилучення ДНК.

    Аналіз РНК проводиться для вивчення моделей експресії генів в клітині. РНК, природно, дуже нестабільна, оскільки РНК зазвичай присутні в природі і їх дуже важко інактивувати. Подібно до ДНК, екстракція РНК передбачає використання різних буферів та ферментів для інактивації макромолекул та збереження РНК.

    Гелевий електрофорез

    Оскільки нуклеїнові кислоти є негативно зарядженими іонами при нейтральному або основному рН у водному середовищі, вони можуть бути мобілізовані електричним полем. Гелевий електрофорез - це методика, яка використовується для поділу молекул на основі розміру за допомогою цього заряду і може бути відокремлена як цілі хромосоми або фрагменти. Нуклеїнові кислоти завантажуються в щілину біля негативного електрода пористої гелевої матриці і тягнуться до позитивного електрода на протилежному кінці гелю. Менші молекули рухаються крізь пори в гелі швидше, ніж більші молекули; ця різниця в швидкості міграції відокремлює фрагменти виходячи з розміру. Існують стандартні зразки з молекулярною вагою, які можна запустити поряд з молекулами, щоб забезпечити порівняння розмірів. Нуклеїнові кислоти в гелевій матриці можна спостерігати за допомогою різних флуоресцентних або кольорових барвників. Виражені фрагменти нуклеїнової кислоти з'являються у вигляді смуг на певних відстанях від верхньої частини гелю (кінець негативного електрода) на основі їх розміру.

    зображення
    Малюнок\(\PageIndex{1}\): Гелевий електрофорез: Показані фрагменти ДНК з семи зразків, запущені на гелі, забарвлені флуоресцентним барвником і переглянуті під ультрафіолетовим світлом.

    Ампліфікація фрагментів нуклеїнових кислот полімеразною ланцюговою реакцією

    Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - це методика, яка використовується для ампліфікації конкретних областей ДНК для подальшого аналізу. ПЛР використовується для багатьох цілей у лабораторіях, таких як клонування фрагментів генів для аналізу генетичних захворювань, ідентифікація забруднюючої чужорідної ДНК у зразку та ампліфікація ДНК для секвенування. Більш практичне застосування включає визначення батьківства та виявлення генетичних захворювань.

    зображення
    Малюнок\(\PageIndex{1}\): ПЛР Ампліфікація: Полімеразна ланцюгова реакція, або ПЛР, використовується для ампліфікації певної послідовності ДНК. Праймери - короткі шматочки ДНК, що доповнюють кожен кінець цільової послідовності - поєднуються з геномною ДНК, полімеразою Taq та дезоксинуклеотидами. Полімераза Taq - це ДНК-полімераза, виділена з термостабільної бактерії Thermus aquaticus, яка здатна витримувати високі температури, використовувані в ПЛР. Thermus aquaticus росте в басейні Нижнього Гейзера Єллоустонського національного парку. ПЛР із зворотною транскриптазою (ЗТ-ПЛР) схожа на ПЛР, але кДНК виготовляється з шаблону РНК до початку ПЛР.

    Фрагменти ДНК також можуть бути ампліфіковані з шаблону РНК у процесі, який називається ПЛР зворотної транскриптази (ЗТ-ПЛР). Першим кроком є відтворення вихідної ланцюга шаблону ДНК (званої кДНК) шляхом застосування нуклеотидів ДНК до мРНК. Цей процес називається зворотною транскрипцією. Для цього потрібна наявність ферменту під назвою зворотна транскриптаза. Після того, як кДНК зроблена, для її ампліфікації можна використовувати звичайну ПЛР.

    Гібридизація, південний блоттинг та північний блоттинг

    Зразки нуклеїнових кислот, такі як фрагментовані геномні ДНК та екстракти РНК, можуть бути досліджені на наявність певних послідовностей. Короткі фрагменти ДНК, які називаються зондами, розроблені та марковані радіоактивними або флуоресцентними барвниками для полегшення Гелевий електрофорез відокремлює фрагменти нуклеїнової кислоти відповідно до їх розміру. Потім фрагменти в гелі переносяться на нейлонову мембрану в процедурі, яка називається промокання. Фрагменти нуклеїнової кислоти, які пов'язані з поверхнею мембрани, потім можуть бути промацуються за допомогою специфічних радіо-активно- або флуоресцентно маркованих послідовностей зондів. Коли ДНК переноситься на нейлонову мембрану, методика називається Південним блоттінгом; коли РНК переноситься на нейлонову мембрану, це називається північним блоттінгом. Південні плями використовуються для виявлення наявності певних послідовностей ДНК в даному геномі, а північні плями використовуються для виявлення експресії генів.

    зображення
    Малюнок\(\PageIndex{1}\): Методи блоттингу: Південний блоттинг використовується для пошуку певної послідовності у зразку ДНК. Фрагменти ДНК відокремлюються на гелі, переносяться на нейлонову мембрану і інкубуються за допомогою ДНК-зонда, що доповнює цікавить послідовність. Північний блоттинг схожий на південний блоттинг, але РНК запускається на гелі замість ДНК. При західному блоттингу білки запускаються на гелі і виявляються за допомогою антитіл.