1.3: Система обмеження/модифікації бактерій

Last updated
Save as PDF

Page ID: 7426

$ \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } $ $ \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} $$\newcommand{\id}{\mathrm{id}}$ $ \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$ $ \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}$ $ \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}$ $ \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}$ $ \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}$ $ \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}$ $ \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}$ $ \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}$ $ \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$ $\newcommand{\id}{\mathrm{id}}$ $ \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$ $ \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}$ $ \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}$ $ \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}$ $ \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}$ $ \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}$ $ \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}$ $ \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}$ $ \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}$

Система обмеження/модифікації бактерій - це маломасштабна імунна система для захисту від зараження чужорідною ДНК.

Арбер і С.Лінн (1969)

Ефективність покриття бактеріофага лямбда (l фага), вирощеного на штамах E. coli C, K-12 і B, при нанесенні на ці бактерії:

Штам кишкової палички, на якому вирощувався батьківський фаг		Штам кишкової палички для покриття фагом
	C	К-12	Б
C	1	<10 ^-4	<10 ^-4
К-12	1	1	<10 ^-4
Б	1	<10 ^-4	1

Виявлено, що ДНК фагів, вирощених на штамах К-12 та В, має хімічно модифіковані основи, які були метильованими.
Додаткові дослідження з іншими штамами вказують на те, що різні штами мали специфічні метильовані підстави.
Типові ділянки метилювання включають N ₆ положення аденіну, положення N ₄ цитозину або положення C ₅ цитозину.

Малюнок 1.3.1: Метилювання

Крім того, лише дробовий відсоток основ був метильований (тобто, наприклад, не кожен аденін був метильований), і це відбувалося на дуже специфічних ділянках ДНК.
Характерною особливістю ділянок метилювання, було те, що в них задіяні паліндромні послідовності ДНК.

Скріншот (191) .png

Рисунок 1.3.2: Специфічність метилази EcoR1. Рубін і Модрич, 1977

Крім того, що володіють певною метилазою, окремі штами бактерій також містили супутні специфічні ендонуклеазні дії.
Ендонуклеази розщеплюються на місці розпізнавання метилювання або поблизу нього.

Скріншот (193) .png

Малюнок 1.3.3: Розщеплення в місцях метилювання

Однак ці специфічні нуклеази не розщеплювалися б при цих специфічних паліндромних послідовностях, якби ДНК була метильованою.

Таким чином, ця комбінація специфічної метилази та ендонуклеази функціонувала як тип імунної системи для окремих штамів бактерій, захищаючи їх від зараження чужорідними ДНК (наприклад, вірусами).

У штамі бактерій Ecor1 послідовність GAATTC буде метильована на внутрішній основі аденіну (метилазою EcoR1).
Ендонуклеаза EcoR1 в межах одних і тих же бактерій не розщеплює метильовану ДНК.
Тому чужорідна вірусна ДНК, яка не метилюється в послідовності «GAATTC», буде визнана «чужорідною» ДНК і буде розщеплена ендонуклеазою eCoR1.
Розщеплення вірусної ДНК робить її нефункціональною.

Такі ендонуклеази називаються «рестрикційними ендонуклеазами», оскільки вони обмежують ДНК всередині клітини до «себе».

Поєднання рестрикційної ендонуклеази і метилази називається системою «обмеження-модифікація».

Звичайно, цей тип захисної системи б'ється, якщо атакуючий фаг раніше вирощувався на тому ж штамі, що і той, яким він заражає. У цьому випадку фаг матиме свою ДНК вже метильовану у відповідній послідовності, і буде розпізнаватися як «сам» (див. Таблицю вище). Штам E. coli 'C' (вище) - це штам, який не має відомої системи обмеження-модифікації.

Ми обговоримо реплікацію ДНК пізніше, але слід зазначити, що:

реплікація ДНК господаря спочатку матиме одну нитку (батьківську) метильовану, а іншу (зароджується нитку) неметильовану.
Це визнається «самою» і не розщеплюється обмеженням ендонуклеази.
Згодом він метилюється метилазою господаря.

Структурні та біохімічні дослідження показали, що для загальних систем R/M (так званий тип II) метилаза розпізнає і метилює одну нитку дуплексу ДНК, тоді як рестрикційна ендонуклеаза розпізнає обидві нитки ДНК (тобто обидва пасма повинні бути неметилірованние для розпізнавання). Він здатний це зробити, тому що це гомо-димерний білок.

Обмеження ендонуклеаз

Оскільки різні штами та види бактерій мають потенційно різні системи R/M, їх характеристика зробила доступними понад 200 ендонуклеаз з різною послідовністю конкретних місць розщеплення.

Вони є одним з основних інструментів сучасної молекулярної біології для маніпулювання та ідентифікації послідовностей ДНК.
Рестрикційні ендонуклеази прийнято називати на честь бактерії, з якої вона була виділена.

Приклади різних рестрикційних ферментів

Ім'я	Джерело	послідовність розпізнавання	Коментарі
Алу I	Артробактер лютеус	\| 5'… A G C T … 3' 3'… T C G A … 5' \|	«Чотири різака». Листя тупими кінцями до ДНК.
Бафа I	Бактеріїди ламкі	\| 5'… C T A G … 3' 3'… G A T C … 5' \|	«Чотири різака». Листя 5' звис.
Ніч I	Нейсерія сінерея	\| C 5'… C C G G G … 3' 3'… G G C C C … 5' G \|	«П'ять різаків». Середнім підставою може бути як цитозин, так і гуанін. Листя 5' звис. Різні сайти розпізнавання можуть мати некомплементарні послідовності.
Еко Р1	Кишкова паличка	\| 5'… G A A T T C … 3' 3'… C T T A A G … 5' \|	«Шістка різак». Листя 5' звис. Поводиться як «чотири різака» (активність «зірки») у буфері з високим вмістом солі. $44 за 10000 одиниць.
Хей II	Гемофіл єгипетський	\| 5'… Pu G C G C Py … 3' 3'… Py C G C G Pu … 5' \|	«Шістка різак». Пу - будь-який пурин, Ру - будь-який піримідин. Листя 3' звис.
Еко 109i	Кишкова паличка	\| 5'… Pu G G N C C Py … 3' 3'… Py C C N G G Pu … 5' \|	«Сім різак». Пу - будь-який пурин, Ру - будь-який піримідин, N - будь-яка основа. Листя 5' звис. Різні сайти розпізнавання можуть мати некомплементарні послідовності.
Бгл I	Глобігійна паличка	\| 5'… GCCN NNNNGGC … 3' 3'… CGGNNNN NCCG … 5' \|	«Шість різак з перерваним паліндромом». Листя 5' звис. Різні сайти розпізнавання можуть мати некомплементарні послідовності.
Бас HI	Стеаротермофільна паличка	\| 5'… G Pu C G Py C … 3' 3'… C Py G C Pu G … 5' \|	«Шістка різак». Різні сайти розпізнавання будуть взаємодоповнюючими.
Ат II	ацетобактер ацетат	\| 5'… G A C G T C … 3' 3'… C T G C A G … 5' \|	«Шість різак» з 3' звисом. Та ж послідовність розпізнавання, що і Bsa HI, але різне положення розщеплення.
Уд./хв I	Бацила пумілус	\| 5'… C T G G A G N₁₆ … 3' 3'… G A C C T C N₁₄ … 5' \|	Непаліндромний, дистальний розщеплення. Листя 3' звис. $50 за 50 одиниць.
Не я	Нокардія отит	\| 5'… G C G G C C G C … 3' 3'… C G C C G G C G … 5' \|	«Різак вісімки». Листя 5' звис.
БСМ I	Стеаротермофільна паличка	\| 5'… G A A T G C N … 3' 3'… C T T A C G N … 5' \|	«дивний». Листя 3' звис.

Корисність рестрикційних ендонуклеаз полягає в їх специфічності та частоті, з якою відбуваються місця їх розпізнавання в межах будь-якого заданого зразка ДНК.
Якщо існує 25% ймовірності для конкретної бази на будь-якому даному сайті, то можна легко обчислити частоту, з якою будуть відбуватися різні ділянки обмеження ендонуклеази (0,25 ^п):

Специфічність нуклеотидів	Приклад	Частота виникнення
Чотири	Алу I	256 (0.25 Кб)
П'ять	Ніч I	1024 (1,0 Кб)
Шість	Декор I	4096 (4,1 Кб)
Сім	Еко 109i	16384 (16.4 Кб)
Вісім	Не я	65536 (65,5 Кб)

Таким чином, в середньому будь-яка дана ДНК буде містити сайт Alu I кожні 0.25 кілобази, тоді як сайт Not I відбувається один раз приблизно кожні 65.5 кілобази.

Тому Not I є дуже корисним ферментом для виділення великих ділянок ДНК, як правило, в дослідженнях, пов'язаних з маніпуляціями геномної ДНК.
Alu Очікується, що я перетравлю зразок ДНК на безліч маленьких шматочків.

Асортимент фрагментів ДНК представляв би специфічний «відбиток» конкретної ДНК, що перетравлюється. Різні ДНК не давали б однакову колекцію розмірів фрагментів. Таким чином, ДНК з різних джерел може бути або підібрана, або розрізнена на основі збірки фрагментів після рестрикційної ендонуклеази лікування. Вони називаються «Поліморфізми довжини фрагмента рестрикції», або RFLP. Цей простий аналіз використовується в різних аспектах молекулярної біології, а також правоохоронних органів та генеалогії. Наприклад, генетичні варіації, які відрізняють людей, також можуть призвести до меншої кількості або додаткового обмеження місць розпізнавання ендонуклеази.

Рестрикційні ендонуклеази постачаються в різних концентраціях з активністю, заснованою на швидкості розщеплення «стандартних» зразків ДНК.

Одну одиницю активності зазвичай визначають як кількість ферменту, необхідного для перетравлення (або «обмеження») однієї мікрограми еталонної ДНК за одну годину при 37° C.
Довідкова ДНК може насправді мати один або кілька місць розпізнавання відповідної нуклеази. ДНК, що використовуються як «стандартні» зразки, можуть включати фагову l ДНК або плазміду pBr322.
Гідроліз ендонуклеази є спонтанною реакцією і, наприклад, не вимагає додавання АТФ. Реакційні буфери для рестрикційних ендонуклеаз зазвичай містять буферний компонент (зазвичай буфер TRIS 10 мМ навколо рН 8.0), магнієву сіль (часто 10 мMgCl ₂), відновник (зазвичай 1мм дитиотреітол або DTT), захисний білок носія (зазвичай 100 мкг/мл бичачого сироваткового альбуміну або БСА), і сіль (хлорид натрію).
Найбільшим визначальним фактором активності ферменту, як правило, є іонна концентрація (вміст NaCl) буфера. Хоча існують сотні різних ендонуклеаз обмеження, більшість з них можуть проявляти активність між 30-100% за допомогою простої системи з трьох буферів, що містять або низьку (20 мМ), середню (100 мМ) або високу (250 мМ) концентрації солі (NaCl) у вищеописаному буфері.

Ферментні дайджести зазвичай проводять протягом 1-2 годин при 37° C, проте кількісне травлення іноді може бути досягнуто лише після тривалої інкубації (тобто протягом ночі).