1.14: Колонна хроматографія

Цілі навчання

Цілі:

• Поясніть умови зростання бактерій і пов'яжіть це з метою збору білка.
• Поясніть, що мається на увазі під білковим згортанням.
• Опишіть взаємозв'язок між конформацією білка (тривимірною формою) та функцією білка.
• Використовуйте колоночну хроматографію, щоб відокремити білки.

Результати навчання студентів:

Після закінчення цієї лабораторії студенти зможуть:

• Ліза бактеріальних клітин для вивільнення білка.
• Очистіть GFP за допомогою колонки гідрофобної взаємодії.
• Визначте місце розташування ГФП протягом усього процесу очищення.

Вступ

Білки - це біологічні молекули, складені з ланцюжків амінокислот, які набувають тривимірну форму, звану конформацією. Специфічна конформація досягається шляхом складання амінокислотного ланцюга таким чином, що білок може виконувати певну роботу або функцію для клітини. Якщо білок не згортається певним чином, він не може виконати ту роботу, яку б інакше. Білки можна очищати і використовувати як терапевтичні засоби (препарати) для лікування пацієнтів зі специфічними станами. Оскільки очищення специфічних людських білків може бути важким або неможливим з тканин людини або тварин, ми можемо використовувати клітини, такі як бактерії, такі як кишкова паличка для виконання цієї роботи. Ці клітини генетично сконструйовані, щоб зробити білки, що представляють інтерес у великих кількостях, які легше очищаються.

Прикладом лікувального білка є інсулін, який використовується для лікування діабету. Це був перший генно-інженерний білок, який був введений як терапевтичний засіб. Ген людського інсуліну був сконструйований у плазміду, і ця рекомбінантна плазміда була введена в E.coli. Бактеріальні клітини зробили інсулін, який був очищений для використання для лікування діабету.

Аналогічним чином можна виробляти і очищати зелений флуоресцентний білок (gfp). До цієї лабораторії ген gfp був введений в процесі генної інженерії в рекомбінантну плазміду, здатну дозволити E. coli виробляти білок з генетичних інструкцій. Виробництво білка з гена називається експресією. Ця рекомбінантна плазміда була введена в кишкову паличку за допомогою процесу трансформації. Ця лабораторія використовує процес отримання очищеного зеленого флуоресцентного білка для моделювання того, як лікувальні білки очищаються для лікування людиною.

Вам буде надана культура бактерій, які були вирощені та індуковані (стимульовані) для виробництва gfp. Ви будете обробляти бактерії розчином, який буде лізувати (розбивати) клітини, щоб вивільнити білок. Тоді ви будете використовувати процес колоночної хроматографії, в центрі уваги цієї лабораторії. Колонна хроматографія - це метод, що дозволяє розчину перетікати по речовині, яке буде вибірково зв'язувати і відокремлювати компоненти розчину. При цьому крихітні кульки упаковують в трубоподібний стовпчик і розчин, отриманий шляхом бактеріального лізису, дають текти по кулькам. Коли ви проходите інші рішення над колоною, ви зможете зібрати частину розчину, що протікає через намистини, який буде містити набагато більш концентрований і чистий gfp.

Вирощування бактеріальних клітин

Схема зростання бактеріальних клітин добре вивчена. У лабораторних умовах мета полягає в тому, щоб виростити клітини і змусити їх виробляти білок, який ми зацікавлені в очищенні. При використанні оптимальних умов для вирощування кишкової палички відбудеться чотири фази зростання (див. Рис.

Малюнок 1. Крива росту бактерій, що визначає зміну росту з плином часу

1. Під час лаг-фази не відбувається поділу клітин. Клітини готуються до поділу, роблячи нові ферменти і білки, а також копії їх ДНК. Клітини збільшують.
2. У фазі колод відбувається подвоєння чисельності населення. Це називається логарифмічним зростанням. Клітини піддаються бінарному поділу (клітини діляться навпіл) приблизно кожні 20 хвилин для кишкової палички при оптимальних умовах. Інші види бактерій, і кишкова паличка в менш ніж ідеальних умовах, будуть ділитися з різною швидкістю.
3. Стаціонарна фаза настає після фази колоди, коли немає загальної зміни чисельності населення. У цей період поділ клітин еквівалентний загибелі клітин і відбувається, оскільки такі ресурси, як поживні речовини та кисень, виснажуються, а продукти життєдіяльності накопичуються в навколишньому середовищі.
4. Під час фази занепаду або смерті бактеріальної культури клітини відмирають швидше, ніж реплікуються. Популяція клітин зменшується. Це відбувається, коли відходи будуються далі, а запас їжі вичерпується.

ВРАХУЙТЕ: Якщо цікавить ген контролюється опероном, таким як лак-оперон, коли найкращий час для включення гена? Майте на увазі:

• Виробництво білка забирає енергію від процесів росту клітин і поділу клітин.
• Більша кількість клітин буде виробляти більше білка
• Білки можуть з часом деградувати

Передлабораторна діяльність: Think Pair Share - Обговоріть те, що ви вже знаєте

Перед лабораторним періодом ви повинні прочитати матеріал, зробити деякі замітки на свої думки з наступних питань (Think). У лабораторії вас попросять обговорити зі своїм партнером ваші думки і почути їх (Пару). Зробіть додаткові нотатки про нові ідеї під час цієї невеликої дискусії. Нарешті, вас можуть попросити обговорити ваші ідеї з класом (Share). Не очікується, що ви знаєте всі відповіді перед обговоренням класу, але до кінця заняття ви повинні відповісти на запитання повністю та правильно.

1. Який термін розмноження бактерій? Опишіть цей процес.
2. Яку роль відіграють білки всередині клітин?
3. Що відбувається з білковою функцією, якщо білок втрачає або ніколи не досягає належної конформації?
4. Як порядок амінокислот пов'язаний з конформацією білка і, таким чином, функцією білка?
5. Оскільки ми можемо контролювати, коли «увімкнути» або висловити свій ген, коли найкращий час для цього? Щоб допомогти вам визначитися, запитайте себе:
   1. Чи буде виробляти білок забирати енергію?
   2. Чи буде більша кількість клітин виробляти більше вашого білка, що цікавить, ніж менше клітин?
   3. Чи можуть білки деградувати, якщо їх залишити занадто довго?
6. Порівняйте свої блок-схеми між собою перед початком лабораторії. Зверніть увагу на будь-які відмінності та намагайтеся вирішити, які блок-схеми мають/мають більш точну інформацію. Налаштуйте власну блок-схему, якщо це необхідно.

Очищення білка

Трансформовані бактерії можуть розмножуватися в культурі і виробляти цікавий білок. Якщо цей білок буде використовуватися терапевтично, його потрібно буде очистити. Це означає, що інші клітинні компоненти, включаючи інші білки, повинні бути відокремлені від вашого білка. Колонна хроматографія - поширений метод відокремлення білків.

Білки зроблені з амінокислот. Окремі амінокислоти мають різні властивості, такі як гідрофобність (ненависть до води) або гідрофільність (подобається воді), іонний заряд або здатність утворювати слабкі або міцні зв'язки з іншими амінокислотами. Коли білок вперше виробляється в клітині, це довгий ланцюжок амінокислот у порядку, визначеному геном. Порядок амінокислот у білку визначає, як ланцюг буде складатися, щоб виробити тривимірну конформацію білка (див. Рисунок 2). Ця специфічна конформація матиме різні амінокислоти, які взаємодіють один з одним певним чином. Амінокислоти, що стоять перед навколишнім середовищем в складеному білку, можуть взаємодіяти з іншими молекулами. Конкретні групи амінокислот поруч один з одним можуть утворювати місця зв'язування для взаємодії з іншими конкретними молекулами. В цілому ці відносини визначають структуру білка і, таким чином, функцію білка. Уявіть білки, які беруть участь в ферментативних реакціях, як канали в мембранах, в транспортуванні інших молекул, або для зв'язування ДНК. Всі ці білки мають дуже специфічні зв'язуючі взаємодії, визначені амінокислотами в конкретних місцях в складеному білку.

Малюнок 2. Згортання білка

ПИТАННЯ: Якщо окремі амінокислоти обмінюються або видаляються в амінокислотному ланцюжку, ви уявляєте, це вплине на функцію білка?

Правила згортання білка до кінця не вивчені і є областю активного наукового дослідження. Однак було виявлено кілька основних правил. Фактори, які змушують білки складатися певними способами, включають:

1. Слабкі зв'язки будуть утворюватися між амінокислотами з негативним і позитивним зарядом.
2. Між сірковмісними амінокислотами будуть утворюватися міцні (ковалентні) зв'язки. Вони називаються дисульфідними мостами.
3. Гідрофільні амінокислоти розташовуються на зовнішніх поверхнях білків, оскільки вони взаємодіють з середовищем клітин, яка в основному є водою. Гідрофобні амінокислоти ховаються на внутрішній стороні білків або вбудовуються в клітинні мембрани, щоб уникнути контакту з водою в навколишньому середовищі.

Малюнок 3. Рідинна колонка хроматографія

Залежно від вмісту амінокислот в конкретному білку, в цілому він буде приймати гідрофобний або гідрофільний характер. Колонна хроматографія може відокремлювати гідрофільні та гідрофобні білки від решти вмісту клітин. Дрібні намистини, покриті матеріалом, званим смолою, упаковуються в колону. Смола приваблює білки, які зв'язуватимуться зі смолою, оскільки інший вміст клітин протікає повз. Щоб гідрофобні білки прилипали, їх потрібно обробити, щоб викрити зазвичай поховані гідрофобні амінокислоти. Буферні розчини можуть бути використані, щоб викликати денатурацію білків (розгортатися) і викрити амінокислоти, які будуть притягуватися до смоли.

Різні буфери передаються по колонці в порядку, визначеному для найкращого відокремлення цікавлять білки від решти вмісту клітин. На малюнку 14.4 показані три розчини, які використовуються для відділення зеленого флуоресцентного білка від решти клітини. Зв'язуючий буфер денатурує білки так, що гідрофобні амінокислоти прилипають до смоли. Буфер для промивання видаляє нещільно прилиплі білки і матеріал з колони, залишаючи більш сильно прикріплений білок, що цікавить. Нарешті, елюїційний буфер, який має низьку буферну концентрацію, змушує білок розкладатися, щоб приховати гідрофобні амінокислоти, які вивільняють білок із смоли, покритих кульками в колонці. Частина або частка рідини, що виходить з колонки, яка містить ваш білок, може бути захоплена в контейнері і збережена.

Малюнок 4. Поділ зеленого флуоресцентного білка за гідрофобністю за допомогою колонкової хроматографії

ПИТАННЯ: Чи вважаєте ви, що всі види білка використовували б однакові типи намистин, покритих смолою, і ті ж типи буферів, щоб стати очищеними? Поясніть свою відповідь.

Частина I: Лізис бактеріальних клітин

Раніше бактерії трансформувалися за допомогою рекомбінантної плазміди, здатної експресувати gfp при індукуванні клітин. Причина, по якій клітини можуть бути спонукані виробляти білок, полягає в тому, що всередині плазміди, перед геном для gfp, існує спеціальна послідовність ДНК, яка реагує, якщо хімічна речовина поміщається в середовище. Ця хімічна речовина називається індуктором (ind) і сигналізує про те, що ген повинен бути «включений», а РНК месенджера повинна бути транскрибована з інструкцій ДНК і білок повинен бути вироблений. Плазміда також містить обраний ген стійкості до ампіциліну (амп), щоб переконатися, що клітини, що ростуть у вашій культурі, є клітинами, які містять вашу плазміду.

До цього лабораторного періоду клітини вирощували в присутності ампіциліну до пізньої фази журналу. Клітини в культурі діляться, і кожна клітина містить багато копій плазміди. На пізній фазі журналу хімічний індуктор був доданий до середовища для включення гена gfp, і клітинам було дозволено продовжувати рости і виробляти gfp.

Спочатку ви будете збирати свої клітини і розбивати їх. Цей процес називається клітинним лізисом. Після того, як клітини будуть лізовані, ви будете використовувати колонку хроматографії для очищення gfp.

МАТЕРІАЛИ

Реагенти

• Стійка для труб Microfuge з наступними трубками:
  • Культура LB/AMP/IND клітин кишкової палички (ЕС)
  • Буфер елюції (EB)
  • Буфер лізису (LyB)
• Екстра 1мл культури ЕК — від інструктора

Обладнання та витратні матеріали

• Мікропіпетка П-200
• Коробка наконечника піпетки
• Перманентний маркер
• Мікроцентрифуга (спільна з класом)
• Вихровий змішувач (спільний з класом)
• Довгохвильове ультрафіолетове світло
• Контейнер для рідких відходів
• Гострий контейнер
• Біонебезпечний мішок для матеріалів, що контактують з клітинами кишкової палички (спільно з класом)

Нагадування про безпеку

У будь-який час слід застосовувати відповідні заходи безпеки. Вони будуть розглянуті вашим інструктором і можуть бути знайдені на початку вашого лабораторного посібника, до якого ви повинні звернутися, перш ніж почати цю процедуру. Асептична техніка потрібна при поводженні з E.coli та матеріалами, які контактували з бактеріальною культурою. Пам'ятайте, що асептична техніка - це процедури, які використовуються для захисту вашої культури та зразків від забруднення, а також захисту вас.

1. Продезінфікуйте робочу зону і вимийте руки перед початком експерименту.
2. Ніколи не торкайтеся нічого, що контактувало з E.coli. Сюди входять піпетки, розкидачі та внутрішня частина трубок. Наконечники піпетів ніколи не повинні торкатися нічого, крім матеріалу, який потрібно перенести. Розкидачами і піпетками слід обробляти тільки з того кінця, який не буде торкатися бактерій.
3. При обробці чашок Петрі відкрийте лише кришку, достатню для роботи з поверхнею агару, а потім негайно закрийте кришку. Це дозволить уникнути забруднення, наприклад, грибкових спор з повітря, висаджуючи на вашу агарову тарілку.
4. Якщо щось стає випадково забрудненим, поговоріть зі своїм інструктором, щоб дізнатися, чи є заміна відповідною та доступною.
5. Уникайте розливів. Якщо таке відбувається, негайно повідомте інструктора про допомогу в його чищенні належним чином.
6. Забруднені відходи, такі як використані мікрофужні трубки та розкидачі клітин, будуть поміщені в мішок з біологічною небезпекою. Наконечники піпетів будуть поміщені в контейнер для гострих сортів.
7. Тільки тоді, коли це буде вказано, ви утилізуєте використані чашки Петрі в біологічно небезпечних відходах.
8. Обов'язково очистіть робочу зону та вимийте руки перед виходом з лабораторії.

Процедури

1. Візьміть довгохвильове ультрафіолетове світло і подивіться на ЕК трубку, запишіть свої спостереження.
2. Зважте свою ЕК трубку. Шукайте іншу трубку з подібною вагою; +/- 0,1 г або створіть балансувальну трубку для мікроцентрифуги.
3. Обертайте ЕК трубку протягом 5 хвилин при 13,000 об/хв (або якомога більшій швидкості) в мікроцентрифузі. Переконайтеся, що правильно врівноважуйте трубки.
4. Дуже обережно виймаємо ЕК пробірку з мікроцентрифуги. Уникайте порушення клітинної гранули в нижній частині трубки.
5. Візьміть мікропіпетку Р-200, встановіть її на 200,0 мкл і отримаєте наконечник. Натисніть до першої зупинки перед входом в супернатант (шар рідини) і обережно витягніть старе рідке середовище для росту. Не турбуйте гранули клітин при цьому.
6. Відкиньте рідину в ємність для рідких відходів, а наконечник в ємність для гострих відходів.
7. Принесіть свою клітинну гранулу (ЕК трубку) інструктору, щоб дозувати 1 мл тієї ж культури в пробірку.
8. Повторіть кроки 2-6, тому знову відкрутіть осередки на 5 хв і видаліть супернатант. Запишіть колір супернатанта та гранул на цьому кроці.
9. Візьміть мікропіпетку Р-200 і новий наконечник і обережно постарайтеся повністю видалити всю рідину з гранули, не займаючи клітини. Відкиньте кінчик в гострі.
10. Встановіть P-200 на 150.0 мкл і отримайте новий наконечник. Додайте 150 мкл буфера елюції (EB) до ЕК трубки. Відмовтеся від наконечника.
11. Щільно закрийте ЕК трубку і повторно підвісьте клітинну гранулу вихровим вихровим пристроєм. Якщо такий недоступний, швидко перетягніть трубку через порожню стійку для мікрофуги. Це повинно спричинити витіснення клітинної гранули з дна трубки, а буфер повинен стати каламутним. Повторюйте цей рух до тих пір, поки вся гранула не зникне.
12. Візьміть П-200 і отримаєте новий наконечник. Додайте 150 мкл буфера лізису (LyB) до ЕК трубки. Змішайте вміст трубки за допомогою вихрового апарату або методом стійки мікрофуги, як раніше.
13. ЕК трубка буде інкубувати в буфері лізису протягом ночі при кімнатній температурі. Позначте свою трубку періодом класу та номером групи та дайте інструктору, щоб зробити цей крок.
14. Очистіть робочу зону та викиньте всі забруднені трубки та наконечники у відповідні біологічно небезпечні відходи.

Частина II: Використання колоночної хроматографії для відділення зеленого флуоресцентного білка

Матеріали

Реагенти

• Мікрофужна трубка стійка з ЕК трубкою, яка містить клітини, буфер елюції та буфер лізису
• Пляшки:
• Буфер зв'язування (BB) = 4,0 М розчин сульфату амонію
• Буфер рівноваги (еквалайзер) = 2,0 М розчин сульфату амонію
• Промити буфер (WB) = 1,3 М розчин сульфату амонію
• Буфер елюції (ЕБ) = 10 мМ Трис, 1 мМ ЕДТА, рН 8,0 розчин
• 20% розчин етанолу (для очищення та зберігання смоли в колонках в кінці лабораторії)

Обладнання та витратні матеріали

• Мікропіпетка П-1000
• Коробка наконечника піпетки
• Мікрофужні пробірки 2-3, 1,5 мл
• Колонка хроматографії
• Мікроцентрифуга (спільна)
• Контейнер для рідких відходів
• Контейнер для біонебезпечних відходів
• Гострий контейнер

Порядок дій

1. Розділіть роботу, доручивши одній людині виконати крок 2-3, інший 4-5, а третій зробити 6-7.
2. Переконайтеся, що у вас є всі необхідні матеріали.
3. Позначте одну мікрофужну трубку як «SUPER», а іншу - як «GFP».
4. Налаштуйте колонку за вказівкою, завжди підтримуйте її у вертикальному положенні. Ніколи не дозволяйте колоновій смолі повністю висохнути.
5. Щоб налаштувати колонку:

• Знімаємо ковпачки у верхній і нижній частині колони. Не плутайте нижню кришку з запірним краном.
• Помістіть колону ємність для рідких відходів біля основи колони.
• Поверніть запірний кран у вертикальне положення і злийте колонку до тих пір, поки над смолою колонки не залишиться 1-2 мм рідини. Поверніть запірний кран в горизонтальне положення, щоб закрити клапан.
• Візьміть мікропіпетку P-1000, прикріпіть наконечник і встановіть на 1000 мкл. Додайте 1000 мкл буфера рівноваги (еквалайзера) обережно вниз збоку колони, намагаючись якомога менше порушити шар смоли.
• Злийте колонку до тих пір, поки 1-2 мм рідини не залишиться над смолою колони, потім закрийте клапан.
• Використовуючи той самий наконечник, додайте ще 1000 мкл буфера рівноваги (EQ) обережно вниз стороною колони, намагаючись якомога менше порушити шар смоли. Після цього відмовтеся від наконечника.
• Злийте колонку до тих пір, поки 1-2 мм рідини не залишиться над смолою колони, потім закрийте клапан.
• Двічі перевірте, щоб рідина перестала стікати при закритому клапані.

6. Зважте ЕК трубку, знайдіть балансувальну трубку і обертайте трубку вниз протягом 5 хв при 13,000 об/хв (або найвищій швидкості) в мікроцентрифузі. Обов'язково збалансуйте мікроцентрифугу.
7. Акуратно вийміть трубку і поверніть її в робочий простір. Запишіть свої спостереження при використанні довгохвильового ультрафіолетового світла для дослідження трубки. Що ви спостерігаєте щодо гранул та супернатанта?
8. Візьміть мікропіпетку Р-1000, встановіть на 250 мкл і отримаєте наконечник. Дуже обережно постарайтеся видалити якомога більше супернатанта і перенести в пробірку з маркуванням «SUPER». Якщо пелет порушився під час цього кроку, знову поверніть трубку вниз і повторіть цей крок. Відкиньте порожній наконечник в гострі.
9. Отримайте новий наконечник і додайте 250 мкл зв'язуючого буфера (BB) до трубки SUPER. Акуратно піпеткою вгору і вниз два рази перемішати розчин. Зараз має бути приблизно 500 мкл рідини.
10. За допомогою того ж наконечника додайте 200 мкл розчину трубки SUPER в колонку два рази. Весь вміст тюбика SUPER слід додати в колонку. Повільно капати розчин по сторонам колони, так шар смоли порушується якомога менше. Відкиньте кінчик в гострі.
11. Поверніть запірний кран і злийте рідину з колонки до тих пір, поки над смолою не залишиться 1-2 мм рідини.
12. Використовуйте довгохвильове ультрафіолетове світло, щоб вивчити стовпець і записати свої результати. Де знаходиться зелений флуоресцентний білок на цьому етапі?
13. Візьміть мікропіпетку P-1000 і встановіть її на 1000 мкл і отримаєте новий наконечник. Додайте 1000 мкл буфера для промивання (WB) обережно вниз по стороні колонки, знову намагаючись якомога менше порушити шар смоли. Відкиньте кінчик в гострі.
14. Злийте промивний буфер до тих пір, поки над смолою не залишиться 1-2 мм рідини.
15. Використовуйте довгохвильове ультрафіолетове світло, щоб вивчити стовпець і записати свої результати. Де знаходиться зелений флуоресцентний білок на цьому етапі?
16. З новим наконечником для піпетки P-1000 додайте 1000 мкл буфера елюції два рази до колони (загалом 2 мл буфера елюції). Повільно додайте буфер вниз по сторонам стовпця. Відкиньте кінчик в гострі.
17. Тримайте трубку «GFP» під запірним краном колонки. Інша людина повинна світити ультрафіолетовим світлом на колонці, щоб можна було розташувати GFP. Відкрийте запірний кран і зберіть ГФП в трубку GFP. НЕОБОВ'ЯЗКОВО: Для цього кроку, якщо у вас є додаткова мікрофужна трубка, ви можете зібрати слабшу флуоресцентну рідину в одному, а сильніше світіння в іншому, щоб сконцентрувати GFP.
18. Після того, як GFP здебільшого збирається, злийте колонку в контейнер для відходів, поки 1-2 мм рідини не виявиться над смолою.
19. З новим наконечником додайте 1000 мкл розчину для зберігання - 20% етанолу тричі вниз збоку колони.
20. Злийте колонку до тих пір, поки над шаром смоли не залишиться 1 см рідини.
21. Покладіть ковпачки назад на верхню і нижню частину колони для зберігання.
22. Утилізуйте потік колонки через контейнер для відходів, виливши вміст у злив в раковину.

Аналіз даних

Перебуваючи під ультрафіолетовим світлом, порівняйте трубку GFP з трубками GFP з інших груп. Запишіть будь-які спостережувані відмінності в інтенсивності кольору у вашій лабораторній книзі.

Навчальні питання

1. Які характеристики амінокислот важливі для конформації білка?
2. Як конформація білка пов'язана з білковою функцією?
3. Ви помітили, чи ваш лізований клітинний розчин виглядав більш-менш яскравим, ніж фракція, яку ви зібрали з колонки? Якщо ви спостерігали різницю, чому це може бути так?
4. Чому ви можете використовувати колонку, щоб відокремити зелений флуоресцентний білок від інших клітинних компонентів?
5. Для цієї процедури, що може бути скориговано, щоб підвищити чистоту вашого білка в зразку?