Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

1.11: Справа про батьківство з електрофорезом

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    6241

    • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

    Цілі навчання

    Цілі:

    • Виконати електрофорез агарозного гелю на зразках.
    • Дізнайтеся, як аналізувати відбитки пальців ДНК.

    Підсумки навчання студентів:

    Після закінчення цієї лабораторії студенти зможуть:

    • Розділяють молекули за допомогою електрофорезу.
    • Проаналізуйте смуги, отримані в результаті гелевого електрофорезу.
    • Визначити батьківство потомства за допомогою аналізу відбитків пальців ДНК.

    Частина I: Агарозний гель електрофорез

    Вступ

    Гелевий електрофорез - дуже поширена і корисна методика поділу молекул ДНК, РНК та білків на основі молекулярного розміру та заряду. Агароза - це полісахарид, що міститься в морських водоростях, який утворює гелеву матрицю (сітка отворів різного розміру). Коли електричний струм пропускається через буфер і гель, молекули в зразку рухаються в сторону електрода з протилежним зарядом. Молекули ДНК, РНК та білка зазвичай мають негативний загальний заряд і рухаються до позитивного електрода. Менші молекули можуть переміщатися по матриці гелю швидше, ніж більші молекули.

    ДНК-дактилоскопія використовує смугові візерунки, які є результатом специфічної обробки зразків ДНК для виявлення зв'язку зразка до еталонних зразків. У цій лабораторії ви будете проводити моделювання активності відбитків пальців ДНК, щоб ознайомитись з цим процесом. Ви завантажите зразки на гель і розділіть смуги в кожному зразку для створення конкретних візерунків за допомогою гелевого електрофорезу.

    Приготування гелів агарози

    Існують різні запущені буфери, які можна використовувати для поділу ДНК. Деякі з часто використовуваних буферів називаються TAE (Трис ацетат ЕДТА), TBE (Тріс Борат ЕДТА) та SB (Борат натрію). Завжди використовуйте один і той же буфер, щоб зробити гель агарози і запустити електрофорез.

    МАТЕРІАЛИ

    • Порошок агарози
    • Шпатель
    • Зважуйте човен
    • 20x запас
    • градуйовані циліндри
    • Піпетад
    • Серологічна піпетка
    • Колба з вентильованим ковпачком

    УСТАТКУВАННЯ

    • Баланс
    • Мікрохвильова піч

    ПРОЦЕДУРА

    1. Приготуйте 500 мл 1X буфера борату натрію з 20-кратного розчину.
      1. Відміряйте 25 мл 20X буферний запас борату натрію в градуйованому циліндрі 25 мл і вилийте в ємність об'ємом 500 мл.
      2. Відміряйте 475 мл ді-води в градуйованому циліндрі об'ємом 500 мл і налийте в ту ж ємність.
      3. Щільно закрити кришкою і перемішати.
    2. Приготуйте 50 мл 0,8% (w/v) агарози в 1X буфері Borate натрію, щоб залити чотири гелі Mini One. Відзначимо, що агароза (і желатин) - це дві речовини, які готуються особливим чином, так як вони можуть розчинятися тільки в киплячих рідинях. Отже, ми НІКОЛИ не кладемо порошок агарози (і желатин) в градуйовані циліндри. Замість цього висипаємо порошок в кінцеву ємність (колбу Ерленмейера).
      1. Відміряйте 50 мл 1X буфера з градуйованим циліндром 50 мл і вилийте в колбу Ерленмейера.
      2. Відміряйте 0,4 г порошку агарози і висипте в ту ж колбу. Так буде виглядати непрозора суспензія.
      3. Використовуйте вентильований ковпачок, якщо це можливо (або без ковпачка). Помістіть колбу в мікрохвильовку і включіть (на 1 хвилину) на високому рівні. Тримайте пильно стежте - не допускайте закипання рідини!
      4. Слідкуйте за бульканням рідини. Як тільки рідина почне пузиритися, зупиніть мікрохвильовку, за допомогою рукавиць або силікону «Гарячі руки» закрутіть колбу 2-3 рази.
      5. Потім замінити і знову включити мікрохвильовку для другого кипіння.
      6. Як тільки рідина почне пузиритися, зупиніть мікрохвильовку, використовуйте рукавиці або «Гарячі руки», щоб притримати колбу до стельового світильника. Уважно шукайте будь-які цятки або кристали в рідині. Коли в прозорому розчині більше не видно цяток, значить, агароза повністю розплавилася.
      7. Поставте колбу на стіл і дайте охолонути до 60oC. Коли ви вперше зможете тримати колбу голими руками, то агарози досить прохолодно, щоб розлити в лотки. Не варто поливати агарозу занадто гарячою, так як відливні гелі будуть викривлятися і потріскати. Не охолоджуйте агарозу занадто довго, так як гель не буде полімеризуватися рівномірно.
      8. Підготуйте ливарні лотки та потренуйтеся завантажувати зразки гелю, поки ви чекаєте.

    Кастинг агарозних гелів (MINI ONE EMBITEC GEL SYSTEM)

    1. Помістіть два прозорі акрилові ливарні лотки в білу підставку для лиття.
    2. Вставте 9-луночний гребінець у відповідний слот стійки для лиття.
    3. Для вимірювання та перенесення 12,5 мл розплавленого розчину агарози в кожен лоток для лиття найкраще використовувати піпет-допомогу та 25 мл серологічного піпету. Або залити розчином агарози до 1/3 вгору гребінця.
    4. Швидко переміщайте або вискакуйте бульбашки повітря за допомогою наконечника піпета або гелевої гребінця Вставте гелеву гребінець у відповідний слот.
    5. Не рухайте і не натикайте гелевий лоток, поки гель не застигне приблизно за 15 хвилин.
    6. Зберігайте додатковий розчин агарози в колбі, покритій параплівкою або ковпачком, при температурі 4oC для подальшого використання.

    Практика завантаження зразків гелю

    Завантаження зразків гелю - це навик, який вимагає практики, щоб навчитися! Справжній гель агарози, який ви будете використовувати для електрофорезу, дуже делікатний і його легко проколоти. Практичний гель не можна проколоти, але забезпечує однакові розміри свердловин для дозування ваших зразків. Оскільки ДНК зрозуміла, зазвичай до зразків ДНК додають кольоровий завантажувальний барвник. Гліцерин високої щільності також додається до завантажувального барвника, так що зразки ДНК швидко потраплять на дно свердловини.

    Порада лабораторії: Завантажуючи зразки в гелеві свердловини, натискайте поршень мікропіпетки лише до першої зупинки, НЕ натискайте на другу зупинку. Обов'язково тримайте великий палець натиснутим на поршень, поки мікропіпетка повністю не вийде з буферної ємності.

    1. Отримайте практичний уретановий гель.
    2. Покрийте гель деіонізованою водою. Якщо в лунках є бульбашки, використовуйте пластикову трансферну піпетку для видалення бульбашок.
    3. Використовуйте наконечник піпетки на мікропіпетці P20 і встановіть циферблат на 10.0 uL.
    4. Натисніть і утримуйте поршень мікропіпетки до першої зупинки.
    5. Візьміть 10 мкл практичного червоного барвника і повільно відпустіть великий палець.
    6. Тримайте мікропіпетку вертикально (див. Рис. 1) над практичним гелем, такий наконечник знаходиться нижче рівня води і трохи вище свердловини. Немає необхідності, щоб наконечник входив в колодязь, так як важкий гліцерин буде тягнути зразок вниз на дно колодязя.
      image3.png
      Малюнок 1. Правильне позиціонування наконечника мікропіпетки
    7. Натисніть поршень тільки до ПЕРШОЇ ЗУПИНКИ і тримайте там великий палець. (Необов'язково: спробуйте натиснути на другу зупинку, щоб побачити, що станеться.)
    8. Рухайте всю руку вгору, щоб мікропіпетка вийшла з води, потім дозвольте великому пальцю відірватися від плунжера. (Необов'язково: спробуйте відпустити великий палець, поки піпетка все ще знаходиться у воді, щоб побачити, що станеться).
    9. Практикуйте завантаження 10,0 мкл червоного барвника в три або більше лунок практичного гелю.
    10. Ви повинні бути в змозі побачити кольоровий зразок, що випадає вниз на дно колодязів.

    Порада лабораторії: Якщо все зроблено правильно, весь зразок залишиться в колодязі. Перевірте, чи немає кольорового барвника, що спливає з верхньої частини колодязя, а це означає, що зразок може забруднити іншу свердловину. Перевірте, чи немає барвника, що витікає з дна свердловини, а це означає, що ви прокололи лунку, і зразок може не потрапити в гель.

    ЧАСТИНА II: Справа про батьківство: Хто батько моїх кошенят?

    У Мері є білий кіт на ім'я «Мед», який загинув два дні близько трьох місяців тому. Зараз у неї чотири кошенята (фото 1), і Мері хоче знати, чи можуть дві сусідні коти, «Том» чи «Бутч», бути батьком кожного кошеня. Щоб проаналізувати свій відбиток ДНК, Мері зібрала волосяні фолікули у кожного дорослого кота та кошеня, витягла ДНК та ампліфікувала ДНК за допомогою полімеразної ланцюгової реакції.

    фото дорослої помаранчевої і білої кішки і 4 кошенят також помаранчевий і білий
    фото помаранчевої і білої кішки
    фото помаранчевої кішки
    Малюнок 2: Зліва направо. Мед і її чотири кошенята (по порядку): Вершки, Патока, Імбир, Цукор; потенційні батьки Том і Бутч.

    гіпотеза

    Використовуючи фотографію, заповніть таблицю 1 своїм прогнозом батька кожного кошеня.

    Таблиця 1. Гіпотеза про батьківство кошенят

    Кошеня

    Потенційний батько

    міркування

    Крем

    Меляса

    Імбир

    Цукор

    Матеріали

    Реагенти

    • Попередньо литий 0,8% гель агарози
    • Сім зразків у мікрофужних пробірках. По одному на кожного котячого
    • 135-150 мл 1X біговий буфер натрію (достатньо, щоб занурити гель агарози)

    Обладнання та витратні матеріали

    • Система електрофорезу, така як MiniOne або іншої марки з гелевою камерою та джерелом живлення
    • Мікропіпетки П-20 і відповідні наконечники
    • Стільниковий телефон або камера для фотографування гелю для документування результатів

    Порядок дій

    1. ПРИМІТКА: Наступне завершується, коли камера електрофорезу була підготовлена з 0,8% агарозного гелю та 1x буфера борату натрію в камері. Не забудьте належним чином задокументувати вашу процедуру у вашій лабораторній зошиті.
    2. Отримайте «зразки ДНК» — є сім мікрофужних пробірок з маркуванням P- V.
    3. Використовуючи мікропіпеттор P-20 і наконечник піпета, виміряйте 10 мкл з трубки P і перенесіть в першу лунку гелю агарози. Обов'язково дотримуйтесь порядку завантаження гелю, зазначеного в колонці 1 - Ну.
    4. Використовуючи новий наконечник для кожного зразка, перенесіть 10 мкл кожного зразка в нові лунки гелю.
    5. Обов'язково стежте за завантаженням зразка, якщо ви не дотримуєтесь наведеної нижче таблиці. Якщо виникли якісь проблеми з навантаженням (проколотий гель, недостатньо проби), обов'язково напишіть в графі NOTE.
    Таблиця 2. Завантаження нотаток: Включіть будь-які відхилення або примітки у свій лабораторний зошит

    Колодязь

    Трубка

    Зразок ДНК 10 мкл

    Примітки для завантаження

    1

    Р

    Том (чоловік)

    2

    Q

    Крем (кошеня)

    3

    Р

    Патока (кошеня)

    4

    S

    Мед (жіночий)

    5

    Т

    Імбир (кошеня)

    6

    У

    Цукор (кошеня)

    7

    V

    Буч (самець)
    1. Якщо використовується система електрофорезу MiniOne, запускайте гель протягом 15 хвилин, поки кольорові смуги не розділяться. Якщо використовується інша система електрофорезу, запустіть гель на 135 В, поки фронт барвника не буде.
    2. Для кращого перегляду результатів візьміть лоток для лиття (з гелем) з буферної ємності, посуньте гель на білий ламінований папір, позначте зразки (і назву вашої команди) і зробіть фотографію.
    3. Оскільки зразки ДНК будуть дифундувати через гелі агарози, ви завжди повинні швидко записувати результати після вимкнення електрофорезу.

    АНАЛІЗ

    1. Використовуйте кольорові олівці для запису візерунків смуг (розфарбуйте відповідні блоки) у таблиці даних нижче.
    Таблиця 3. Кольорові смуги «ДНК», розділені електрофорезом агарозного гелю

    Трубка

    П

    Q

    R

    S

    Т

    U

    V

    Смуга

    Том (Чоловік)

    Крем

    Меляса

    Мед (жіночий)

    Імбир

    Цукор

    Буч (чоловічий)

    Блакитний #1

    Блакитний #2

    Рожевий #1

    Фіолетовий #1

    Жовтий #1

    Жовтий #2
    1. Уважно розгляньте кожну групу з усіх чотирьох зразків кошенят і визначте, чи відповідає група Тому, Меду або Бутчу. Для зразків кошеня (стовпці QRTU) у таблиці даних 3 напишіть (всередині кольорових блоків), хто відповідає цій смузі — Том, Мед або Буч.
    2. Робіть свої висновки на основі «доказів ДНК».
    3. Заповніть 2-й і 3-й стовпці в таблиці 4 нижче. Порівняйте свою гіпотезу в таблиці 1, де ви вгадали батька для кожного кошеня на основі видимості вашого висновку щодо батька на основі доказів ДНК. Чи була ваша гіпотеза правильною для кожного кошеня?
    4. Які конкретні докази виправдовують ваш висновок, що визначає батька кожного кошеня? Заповніть свої відповіді на ці питання в таблиці нижче.
    Таблиця 4. Порівняння гіпотези та висновку, підкріпленого експериментальними даними

    КОШЕНЯ

    БАТЬКО на основі візуального

    БАТЬКО на основі ДНК

    Докази

    Крем

    Меляса

    Імбир

    Цукор

    Навчальні питання

    1. Під час гелевого електрофорезу ДНК буде мігрувати до якого електрода?
    2. Якби у вас були молекули ДНК, які були малими, середніми, довгими та надзвичайно довгими, які були б найближчими до дна гелю після електрофорезу?
    3. Що ви знаєте про візерунок смуг, які виникають внаслідок потомства, оскільки вони стосуються матері та батька?
    4. Якби ви провели аналіз відбитків пальців ДНК, але схема смуги для потомства не відповідала жодному з батьків, що б ви зробили висновок?