14.1: Вступ
- Page ID
- 6543
Генетичні маніпуляції (селекція)
Генетична модифікація організмів відбувається через маніпуляції людиною з початку сільського господарства. Люди вибірково розводять сільськогосподарські культури та худобу для розмноження бажаних ознак у процесі, який називається штучним відбором. Оригінальна трава, яка породила одомашнену кукурудзу під назвою теосінте, навряд чи нагадує те, про що ми думаємо, уявляючи сучасну кукурудзу.
Теосінте, прабатька кукурудзи. Кукурудза з'явилася завдяки селективній селекції. Кредит: Джон Доблі (CC-BY)
Варіація: Одомашнення врожаю
Селективне розведення може дати різні особливості навіть у межах одного виду. Нижче наведено добірку овочів виду Brassica oleracea, які були розроблені в різні сорти протягом сільськогосподарської історії.
Капуста: Brassica oleracea var. капітал Кредит: Ліс і Кім Старр (CC-BY 3.0)
Брокколі: Brassica oleracea var. італійська Кредит: Койау (CC-BY-SA 3.0)
Кольрабі: Brassica oleracea var. Гунгілоди Койау (CC-BY-SA 3.0)
Романеско: Brassica oleracea var. Кредит: Річард Бартц (CC-BY-SA 2.5)
Варіація: Одомашнення тварин
Кредит: Мері Блум, Американський кінологічний клуб (CC-BY-SA 4.0)
Тварини-компаньйони, як собаки, зазнали тисячі років одомашнення та відбору ознак, бажаних для різних обставин. Високий ступінь морфологічної різноманітності існує між породами собак та їхнім прабатьком сірого вовка.
Генетичні маніпуляції (інженерні)
Штучний відбір займає кілька поколінь протягом тривалого періоду часу. З появою рекомбінантної ДНК та біотехнології вчені тепер можуть генетично модифікувати організми шляхом впровадження чужорідних генів, щоб забезпечити бажані характеристики протягом одного покоління. Цей процес не вимагає, щоб риси природним чином виникали у виду.
GloFish є трансгенними зебрарибами (Danio rerio), що виражають варіанти GFP. Внизу представлена риба дикого типу. Кредит: Азул (CC-BY)
GloFish® - це новинки домашніх тварин, які мають введення різних генів флуоресцентного білка cnidarian в геном. Ці риби були випущені в США в 2003 році і згодом були розроблені в червоних, помаранчевих і синіх сортах. Також тепер доступні чорні тетри та тигрові барбуси.
Чорний тетра (Gymnocorymbus ternetzi) GloFish Кредит: https://www.flickr.com/photos/fergy08/ (CC-BY 2.0)
Чорний тетра дикого типу Кредит: Фернандограу (CC-BY-SA 3.0)
Генна інженерія у рослин
З появою агробізнесу сільське господарство стало підприємством, орієнтованим на прибуток, незалежно від виробництва продуктів харчування. При цьому висока продуктивність має першорядне значення. Тоді як традиційне сільське господарство або штучний відбір були повільними та методичними, генетична модифікація в контексті агробізнесу відбувається миттєво через генну інженерію. Мета генної інженерії - перенести ДНК, що кодує корисний або сприятливий ген, від організму, який несе цей ген, до того, який цього не робить. Просте введення ДНК в організм не призводить до експресії. Відповідний промотор для трансгенного організму повинен бути вище за течією цікавого гена, щоб керувати транскрипцією. У ссавців сильним промотором, який призведе до експресії в кожній клітині, є промотор ЦМВ, який походить від цитомегаловірусу. Так само у рослин сильний промотор, який працює в кожній клітині, походить від вірусних промоторів, таких як промотор CamV з вірусу мозаїки цвітної капусти з гена 35S (рибосомна РНК). (Послідовність CamV 35S на NCBI)
Приклади корисних рис включають:
- Деградують гербіциди
- Вбити сільськогосподарських шкідників
- Синтезуйте важливі поживні речовини
- Для поліпшення кольору і смаку
- Протистояти пошкодженню під час транзиту або тривалого зберігання.
- Збільшення в розмірах
- Скорочення часу виходу на ринок (більш швидке зростання або дозрівання)
Генетично модифіковані продукти стали гарячою темою суперечок останнім часом. Ці культури генеруються через зараження рослинних клітин бактерією під назвою Agrobacterium tumefaciens. Agrobacterium - грамнегативна альфа-протеобактерія сімейства Rhizobiaceae, яка включає симбіотичні фіксатори азоту, знайдені в бобових. На відміну від цих симбіонтів, Agrobacterium - патогенна ґрунтова бактерія, відома як збудник коронкових галлів (пухлин).
Коронний жовч на каланхое, зараженому Agrobacterium tumefaciens Кредит: Бхай (CC-BY-SA 3.0)
Пухлини викликані інфікуванням рослинних клітин бактерією та подальшим введенням Т-ДНК («Трансферна ДНК»), яка має здатність індукувати пухлину (Ti). Завдяки інженерії Т-ДНК в плазміді вибрані гени можуть бути доставлені до рослинних клітин через зараження трансформованих бактерій.
Плазміда Ti має область Т-ДНК, замінену трансгеном. Він перетворюється в Agrobacterium, який перетворює ДНК в рослинні клітини.
Модифікована плазміда Ti під назвою pGreen була розроблена для забезпечення MCS та маркера відбору для вставки чужорідних генів, що представляють інтерес. Для того, щоб ці гени були експресовані, вони керуються сильними промоторами рослин, такими як гени CamV 35S.
Рослина, яку потрібно розробити, культивується та заражається перетвореними агробактеріями, які потім індукують цисти, які врешті-решт вкорінюються. Сильний промотор CamV 35S конститутивно експресує ген у всіх клітині рослини.
Трансформація дикої картоплі в культурі з використанням агробактерії Кредит: Seb951 (CC-BY-SA 3.0)
Зростання ГМО-культур
Площа земельної ділянки використовується мільйонами гектарів.
Стійкість до пошкоджень
Перший генетично модифікований урожай FDA, затверджений до продажу, був відомий як Flavr Savr томат. Помідори схильні до пошкоджень під час транспортування і тому збирають до дозрівання. Однак дозрілі на винограді помідори мають більш насичений смак. Calgene розробив Flavr Savr і продав його на ринок між 1994-1997 роками в Сполучених Штатах. Flavr Savr був модифікований шляхом введення антисенсу в геном, який збив експресію полігалактуронази. Полігалактуроназа розкладає пектин у клітинних стінках плодів, що призводить до розм'якшення, схильності до пошкодження та можливого гниття.
Стійкість до гербіцидів
Roundup - це торгова назва гербіциду гліфосату, що використовується в сільському господарстві для боротьби з популяціями бур'янів, розробленим та запатентованим Monsanto. Гліфосат всмоктується через листя рослин і втручається в ферменти, які допомагають у виробництві тирозину, фенілаланіну та триптофану. Рослини та нижчі організми генерують ароматичні амінокислоти через фермент 5-енолпірувілшікімат-3-фосфат (EPSP) синтази, який є мішенню цієї сполуки. Серія готових культур Roundup була розроблена шляхом введення гена Agrobacterium EPSP, керованого промотором CamV 35S. Ця версія гена за своєю суттю стійка до отруєння гліфосатом.
Виникнення надбур'янів
Палмер амарант (Amaranthus palmeri), який зазвичай називають іскатом, є видом шкідників на бавовняних і соєвих полах, які стали стійкими до гліфосату.
Кредит: Помпілід (CC-BY-SA 3.0)
Стійкість до шкідників
Кредит: Частина Сінді Сімс (CC-BY-SA)
Кристали Bacillus thuringiensis (Bt), звані білком Cry, токсичні для різних комах: молі та метеликів, жуків, мурах, ос, мух та комарів, бджіл, нематод. Введення цього гена в такі рослини, як кукурудза (Bt-Corn), було розроблено таким чином, щоб бути стійким до шкідників.
Стійкість до хвороб
Папайї в Сполучених Штатах в першу чергу походять з Гаваїв. Вірус, відомий як хвороба кільцевої плями папайї, загрожував врожаю папайї на Гаваях. Для боротьби з цим папайї були генетично розроблені для блокування вірусного проникнення в клітини папайї. Папайї, придбані на латинських ринках, швидше за все, не модифіковані і зазвичай походять з Мексики, де хвороба кільцевої плями ще не є проблемою.
Вірус сливової віспи становить загрозу для роду Prunus. Генетично модифікована слива рослина була розроблена під назвою C5. Клітини цих рослин замовчують експресію білка оболонки сливової віспи, якщо заражені, щоб блокувати розмноження вірусу.
Абрикос, заражений сливовою віспою.
С5 стійкі сливи
Харчова інженерія
Кредит: uk:користувач: Петахолмс, (CC-BY-SA 3.0)
Золотий рис - це генетично інженерний рис, який призначений для вирішення дефіциту вітаміну А. Він вводить ферментні гени інших видів, що беруть участь у біосинтетичних шляхах виробництва β-каротину, попередника вітаміну А. За підрахунками, мільйони смертей та незворотної сліпоти відбуваються в третьому світі щороку через дефіцит вітаміну А, і створення цього рису було призначено для вирішення проблеми.
Рис є основним продуктом у багатьох культурах, тому це хороша система доставки. Багато суперечок існує навколо Золотого рису через настрої проти ГМО (від патентних систем), культурної чутливості (білий рис шанується в певних культурах) та сумніви вмісту вітаміну А та конверсії.
Досліджуйте дебати
- Тематичні дослідження виявляють складні істини за міфами врожаю ГМ.
- Тематичні дослідження: Важкий погляд на ГМ-культур. Гілберт Н. Природа. 2013 Травень 2; 497 (7447) :24-6. doi: 10.1038/497024a
Гетерологічна експресія в культурі тканин
Людські ембріональні клітини нирок (HEK293T), що експресують зелений флуоресцентний білок.
Більш високе збільшення HEK293T, що експресує зелений флуоресцентний білок.
Плазмідна структура
pTarget вектор вираження ссавців. MCS знаходиться всередині гена LacZ, який дозволяє синій/білий скринінг бактерій після клонування. LacZ працює в протилежній орієнтації як промотор CMV, який буде керувати транскрипцією генів, коли всередині клітини ссавців. Сервери походження SV40 як походження плазмідної реплікації, якщо клітинна лінія також виражає великий Т-антиген SV40, такий як клітини HEK293T.
Вектори експресії ссавців містять ті ж ознаки, що і бактеріальні плазміди: реплікація бактерій походження і ген резистентності до бактеріальних антибіотиків (β-лактамаза або Amp R). Загальні особливості бактеріальної плазміди дозволяють проводити перенесення і розмноження плазміди в бактеріальній клітині. Вектори експресії ссавців додатково включають сильний промотор ссавців (наприклад, ЦМВ від негайного раннього промотора цитомегаловірусу) вище за течією багаторазового сайту клонування (MCS). Плазміди, трансфіковані в клітини, носять тимчасовий характер, якщо ДНК не обрана для. Включення гена резистентності до антибіотиків ссавців, як неоміцинова фосфотрансфераза (Neo R), дозволяє інтегрувати плазміду в геном клітини за допомогою високих концентрацій неоміцину або аналога G418.
Ліпофекція
Катіонні ліпіди можуть інкапсулювати плазмідну ДНК в ліпосоми. Катіонні частини взаємодіють з негативно зарядженою плазматичною мембраною для доставки ДНК в клітини.
Трансфекція фосфату кальцію
Розчин хлориду кальцію можна використовувати для інкубації з плазмідною ДНК. Коли цей розчин змішується з гепес-буферизованим сольовим розчином (HEB), що містить фосфатні іони, розчин осідає на поверхню клітин ссавців, де вони захоплюються ДНК.
Нокаут та трансгенез
У лабораторії модельні організми модифікуються, щоб зрозуміти основні механізми генів. Перетворення рекомбінантної ДНК в бактерії є прикладом генетичної модифікації. Інші модельні організми, як миші, використовуються для вивчення генів. За допомогою рекомбінантної ДНК вчені можуть вибірково аблювати ген, або створити нокаут (КО).
Ембріональні стовбурові (ES) клітини є плюрипотентними клітинами, здатними диференціюватися на інші типи клітин. Культурні ЕС-клітини можуть бути трансфіковані плазмідною ДНК, щоб генетично змінити їх. Лінеаризовані вектори, що містять порушений ген, можуть гомологічно рекомбінувати з нативним геном, щоб замінити його. Відбір клітин з порушеним геном антибіотиком (наприклад, G418) дозволяє ізолювати та розмножувати інженерні ЕС-клітини.
Кредит: Каргаард (CC-BY- 3.0)
Кредит: Каргаард (CC-BY- 3.0)
ES клітини можуть вводитися в мишачі бластоцисти і частково сприяти подальшій миші при імплантації в мишу. Ці перші миші називають химерами, оскільки вони виникають із сумішей клітин з 2 генетичних джерел. Зародкова передача модифікованих клітин бажана і розмноження химери виявляє гетерозиготне потомство інженерного фону. Повноцінні нокаут миші можуть генеруватися в подальшому поколінні селекції.
Кредит: Смарт (CC-BY-SA 3.0)
Вчені також можуть надмірно експресувати або гетерологічно виражати чужорідні гени в так званих трансгенних організмах. Як звучить назва, трансген відноситься до гена з одного місця, перенесеного в інше.
Трансгенні та КО моделі дозволяють вченим вивчати ролі генів всередині організму та розуміти основні функції.
За допомогою мутагенезу були отримані похідні зеленого флуоресцентного білка (GFP) для забезпечення палітри кольорів. Крім того, подальше відкриття подібних генів від інших кнідарійських видів сприяло біотехнології, забезпечуючи молекули трасера всередині організмів, що розвиваються або всередині клітин.
Бактерії, що експресують різні похідні GFP на агарі з лабораторії Нобелівського лауреата Роджера Ц
Хоча комерційні організми, такі як GloFish, є новинкою, спрямоване введення GFP та варіантів у геном під різними промоторними системами дозволяють вченим зрозуміти специфічне функціонування клітин або внесок у організм. Приклад цього можна знайти в нейробіології розвитку, де можна простежити окремі аксони.
«Brainbow» - це система, де касета генів-варіантів GFP розміщується нижче за течією нейронального промотора, щоб дозволити відстежувати окремі нейрони та їх аксони у мишей. Кредит: Джефф Ліхтман та Джошуа Санес (CC-BY 3.0)
Мозок 10-денної старої подвійно-трансгенної зебрарибки. Кровоносні судини показані в пурпуровому кольорі (KDRL: MCherry), а нова популяція периваскулярних ендотеліальних клітин показана зеленим кольором (MRC1A: EGFP).