10.2: Бактеріальна трансформація (активність)

Last updated
Save as PDF

Page ID: 6506

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Бактеріальна трансформація

Escherichia coli - комменсальні грамнегативні бактерії, виявлені в кишках людини. Вони мають здатність подвоюватися кожні двадцять хвилин і робити сприятливий носій рекомбінантної ДНК. Плазмідна ДНК може бути введена в кишкову паличку легко після того, як зробити їх компетентними. Одним із методів досягнення цього є хімічна компетентність з тепловим шоком. У цьому процесі бактерії інкубуються в розчині CaCl ₂ на льоду. Холод служить для уповільнення молекулярного руху плазматичної мембрани, тоді як іони Ca ²⁺ видаляють відштовхування заряду-заряду між фосфоліпідами та негативно зарядженою ДНК, яка прагне отримати вхід в клітину. Клітини розміщуються на короткий проміжок часу при 42° C, щоб викликати тепловий шок. Цей тепловий шок призводить до того, що клітина захоплює ДНК. Цей метод відрізняється дуже низькою ефективністю, тому багато бактерій не беруть жодної ДНК. Клітинам дозволено відновлюватися після теплового шоку при 37° C у багатому поживному бульйоні, щоб забезпечити вироблення білків резистентності до антибіотиків, закодованих на векторі як маркер виділення. Потім перетворені клітини поширюються по агарній пластині, що містить антибіотик, який потім вбиває всі нетранформовані клітини. Тільки бактерії, що містять вектор з геном резистентності до антибіотиків, виживуть і розмножуються, утворюючи невеликі колонії на поверхні агару.

Вправа: Трансформація бактерій з RE ідентифікованими плазмідами

Кожна група витягує 2 міні-підготовлені плазміди з попереднього тижня в морозильну камеру і дозволяє відтанути на льоду.
Доведіть 2 тарілки агару до кімнатної температури

2 пластини міститимуть антибіотик, X-Gal та арабінозу

Для кожної плазміди отримайте 250 мкл буфера трансформації (50 мм CaCl ₂) у мікрофужних трубках і покладіть на лід на 10 хвилин.
Візьміть прищеплювальну петлю і видаліть одну колонію бактерій зі свіжовідлушеної пластинки, вирощеної за ніч.
Викрутіть бактерії в кожній трубці, що містить трансформуючий розчин, щоб розподілити бактерії по всьому розчину.
Піпеткою 5 мкл плазміди в пробірку і інкубуйте на льоду протягом 10 хвилин.
Під час цієї інкубації переверніть підігріті тарілки і позначте їх іменами своїх груп.
Помістіть трансформаційні трубки в тепловий блок 42° C на 1 хвилину, щоб нагріти клітини.
Додайте 500 мкл свіжих носіїв SOC (або LB) та інкубуйте при 37° C протягом 15 хвилин.
Піпеткою 150 мкл розчину перетворення на кожну пластину і розподіліть по всій тарілці.
Переверніть тарілки агару стороною вгору і помістіть їх в інкубатор 37° C на ніч. (Ваш інструктор витягне їх і помістить в холодильник).

Гіпотеза: Що я очікую від моїх перетворених клітин?

З попередньої лабораторії ми можемо ідентифікувати наші плазміди. Плазміди - це PgLo, PuC18/19 або PuC18/19 з вставкою 6 кб, що порушує ген LacZ. pGlO містить ген, який кодує білок GFP, який буде флуоресцентним зеленим під ультрафіолетовим світлом і становить 5,4 кб. puC зазвичай має розмір 2,7 кб. LacZ - ген, що кодує білок β-галактозидазу, фермент, який гідролізує лактозу в моносахариди галактозу і глюкозу. X-Gal - хімічна речовина, що нагадує лактозу. Однак при гідролізі молекула відкладає в клітину синє забарвлення.

Файл генбанку PUC19

Файл генбанку pgLo

Puc-Winsert

PuC з вставним файлом

Якщо раніше згадані плазміди були перетравлені eCoRi, позначте смуги нижче відповідною плазмідою (pGlO, PuC та PUC)
Передбачте, чи будуть ваші трансформанти зеленими під УФ, білими в будь-яких умовах або синіми.
Для додаткової допомоги з цієї проблеми, використовувати In silico травлення діяльності.