5.1: Q-ЯМР для визначення чистоти макролідних антибіотиків еталонних стандартів - Порівняння з методом балансу маси

Last updated
Save as PDF

Page ID: 19463

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Макролідні антибіотики отримують з мікробних ферментацій. Як клас макролідних антибіотиків містять 14- або 16-членний макроциклічний лактон, що містить аміногрупи і дезоксицукру. Антибактеріальна активність цих сполук виникає внаслідок пригнічення синтезу бактеріального білка. Оскільки макроліди накопичуються всередині лейкоцитів, вони транспортуються до місця зараження. Деякі макроліди також мають імуномодулюючу дію, здатну зменшити запалення. Одним з найвідоміших макролідних антибіотиків є еритроміцин, будова якого показано тут.

Ця програма вивчає використання кількісних вимірювань ЯМР ¹ Н для визначення чистоти макролідних антибіотиків еталонних стандартів. Були протестовані зразки кларитрміцину, рокситроміцину, азитриміцину, диритроміцину та мідекаміцину. Експерименти Q-ЯМР проводилися на частоті 500 МГц з використанням 1,4-динітробензолу як внутрішнього стандарту. Замість визначення часу релаксації T ₁, затримка релаксації (64 с) була обрана шляхом порівняння пікової площі для внутрішнього стандарту, використовуючи d ₁ затримки 1, 5,10, 20, 32, 64 та 256 с.

Результати Q-ЯМР порівнювали з більш традиційним підходом визначення балансу маси, показаним у таблиці 1 нижче. При визначенні балансу маси вміст обчислюється так, як показано в Рівнянні\(\ref{E1}\).

\[\mathrm{Content\: \% = (1 - impurity\%)(1 - water\% - volatile\: material\: \% - sulfated\: ash\%) \times 100} \label{E1}\]

При цьому визначенні домішка% визначається ВЭЖХ-УФ. Вміст води визначають титруванням Карла Фішера, а залишкові розчинники вимірюють за допомогою газової хроматографії. Кількість сульфатованої золи (перш за все європейське позначення) відповідає кількості залишку, що залишився після займання зразка. Одним з недоліків HPLC-UV для цих вимірювань є відсутність хромофора з характерною довжиною хвилі поглинання. Крім того, загальна проблема такого підходу полягає в тому, що коефіцієнт поглинання УФ кожної домішки різний, і в багатьох випадках невідомий.

Визначення чистоти з використанням ЯМР покладаються на порівняння інтегралів, виміряних для резонансів аналіта (I _x) з інтегралом стандарту кількісного визначення (I _std). В даному випадку використовувався внутрішній стандарт. Оскільки відомі маси зразка (m _x) і внутрішній стандарт (m _std), вміст аналіту можна визначити. Зверніть увагу, що основне припущення в цьому методі полягає в тому, що резонанси домішок не перекриваються з резонансами, використовуваними для вимірювання вмісту аналітів. Чистота аналіту, Px, розраховується так, як показано в Рівнянні\(\ref{E2}\):

\[P_x = \dfrac{I_x}{I_{std}} \dfrac{N_{std}}{N_x} \dfrac{M_x}{M_{std}} \dfrac{m_{std}}{m_x} P_{std} \label{E2}\]

де M _x і M _std - молярні маси аналіта і стандарту, відповідно P _std - чистота стандарту, а N _std і N _x - кількість спінів, що відповідають за інтегрований стандартний і аналітичний сигнали відповідно. Результати вмісту, узагальнені в таблиці 1, для макролідних антибіотиків, отриманих при ¹ Н ЯМР та методом балансу маси, добре узгоджуються. Основним джерелом невизначеності в методі Q-ЯМР був у вазі зразка, близько 15 мг в цих експериментах. Використання більшої маси зменшило б невизначеність результатів, але споживало б більшу кількість дейтрованих розчинників. Інформативною особливістю цього звіту є детальний аналіз помилок, який він містить.

**Таблиця 1**. Результати методів Q-ЯМР та балансу маси (адаптовані з Лю та Ху, Anal. Чим. Акт **2007**, *602*, 114-121)
	¹ Н Q-ЯМР метод (%)			Метод балансу маси (%)
	Середній вміст ^a	ЧЕРВОНИЙ	U _{розширений}	Домішкові/U ₁	Вода/U ₂ ^б	Залишкові розчинники/U ₃ ^b	Сульфатна _{зола/ч 4} ^г	Вміст/U _{розширено}
Кларитроміцин	96.3	0,49	1.89	3,35/0,0299	1,4/0,0148	<0,001/<8,4 х 10 ^-6	0/0	95,3/2,64
Рокситроміцин	95.7	0,44	1.82	2.50/0,0223	2,2/0,0233	<0,001/<8,4 х 10 ^-6	0/0	95.4/2,64
азитроміцин	94.3	0,50	1.36	1,59/0,0142	4,5/0,0486	<0,001/<8,4 х 10 ^-6	0.02/0,0198	94.0/2,75
Діритроміцин	96.9	0	1.81	3,30/0,0295	0,6/0,00636	<0,001/<8,4 х 10 ^-6	0/0	96.1/2.67
Мідекаміцин	97.1	2.0	1.96	3,94/0,0352	0,16/0,000035 ^см		0/0	95.9/1,71
Розраховано за допомогою 4 сигналів ЯМР u ₁ - невизначеність в домішці, u ₂ - невизначеність у воді, u ₃ - невизначеність у залишкових розчинниках і u ₄ - невизначеність сульфатної золи Вміст води та залишкових розчинників для мідекаміцину не визначали. Загальні леткі речовини мідекаміцину визначали методом втрат при сушінні

Довідка

Лю, С.-Ю.; Ху, С.-К. «Порівняльне дослідження невизначеності калібрування еталонних стандартів макролідних антибіотиків з використанням кількісних методів ядерного магнітного резонансу та балансу маси» Анал. Чим. Акт 2007, 602, 114-121.