9.2: ОЛЕНЬ

Чотирьохімпульсний експеримент DEER

Найбільш часто використовуваним експериментом для вимірювань розподілу відстані в нанометровому діапазоні є чотириімпульсний подвійний електронний резонанс (DEER) експеримент (рис. 9.2), який іноді також називають імпульсним електронним подвійним резонансом (PELDOR) експеримент. Всі взаємодії спіна спостерігача перефокусуються двічі двома$\pi$ імпульсами в рази$2 \tau_{1}$ і$2 \tau_{1}+2 \tau_{2}$ після початкового$\pi / 2$ імпульсу. Повторна перефокусування необхідна, оскільки всі спінові пакети повинні перебувати в фазі,$t=0$ а перекриття$\pi$ імпульсу насоса з імпульсом$\pi / 2$ спостерігача призведе до спотворення сигналу. Перша перефокусування з інтерімпульсною затримкою$\tau_{1}$ відновлює ситуацію (1) відразу після$\pi / 2$ імпульсу з фазою$x$, де вектори намагніченості всіх спінових пакетів вирівняні з$-y$ віссю. \({ }^{1}\)На практиці когерентність збуджується на обох спінових переходах спостерігача (синій колір в панелах енергетичного рівня), але для наочності розглядаємо тільки спінову когерентність спостерігача, яка знаходиться на верхньому переході і символізується хвилястою лінією в панелі (1).

Протягом часу$t$ після першої перефокусування вектори намагніченості спінових пакетів з різним резонансним зміщенням дефази (панель (2)). Тільки резонансний спіновий пакет, позначений темно-синім кольором, все ще вирівнюється з$-y$ напрямком. Імпульс насоса перевертає партнера зчеплення і таким чином передає когерентність на нижній спіновий перехід спостерігача. Резонансна частота цього переходу зміщується дипольно-дипольної зв'язкою$d$ у всіх спінових пакетах. Спінова намагніченість спостерігача додатково дефазується до моменту безпосередньо перед застосуванням другого$\pi$ імпульсу спостерігача (3)) і, крім того, весь пучок векторів намагніченості спінових пакетів переступає проти годинникової стрілки зі зсувом частоти$d$. Таким чином, спочатку он-резонансний спіновий пакет отримує фазу$d\left(\tau_{2}-t\right)$ перед тим, як буде застосовано другий$\pi$ імпульс спостерігача. Другий$\pi$ імпульс спостерігача з фазою$x$ відповідає$180^{\circ}$ обертанню навколо$x$ осі. Це відображає пучок векторів намагніченості щодо$y$ осі, інвертуючи фазу спостерігача спінової когерентності (панель (4)). Пучок, який все ще перегинається проти годинникової стрілки з кутовою частотою,$d$ тепер відстає від$+y$ осі за фазою$d\left(\tau_{2}-t\right)$. Під час остаточної інтерпульсної затримки довжини$\tau_{2}$ пучок в цілому набирає фазу$d \tau_{2}$ (сіра стрілка на панелі (4) і одночасно перебудовується вздовж його центру за рахунок перефокусування луни. Однак центр, відповідний спочатку он-резонансному спіновому пакету, не закінчується вздовж$+y$, як це було б при відсутності імпульсу насоса. Швидше, цей спіновий пакет отримав фазу$d t$ щодо$+y$ напрямку (панель (5)). Векторна складова намагніченості уздовж$+y$, яка відповідає ехо-сигналу, задається шляхом$\cos (d t)$.

Малюнок 9.2: Чотириімпульсна послідовність DEER, передачі когерентності та еволюція спінової намагніченості спостерігача. Імпульси, показані синім кольором, подаються на спін спостерігача, імпульс насоса, показаний червоним кольором, прикладається до його партнера зчеплення. Відлуння в часі$2 \tau_{1}$ (пунктирна синя лінія) не спостерігається. Міжпульсні затримки$\tau_{1}$ і$\tau_{2}$ фіксуються, час$t$ змінюється, а амплітуда відлуння спостерігається як функція$t$.

Діапазон відстані експерименту DEER обмежений в сторону коротких відстаней вимогою, що для перефокусування відлуння імпульси спостерігача повинні збуджувати обидва переходи спостерігачів, які розділені на$d$ і, для передачі когерентності, імпульс насоса повинен збуджувати обидва переходи зв'язку партнера, які також розщеплюються$d$. Іншими словами, як спостерігач перефокусованої ехо-підпослідовності, так і імпульс насоса повинні мати пропускну здатність збудження, яка перевищує$d$. Ця вимога встановлює нижню$1.8 \mathrm{~nm}$ межу відстані приблизно на частотах X-діапазону та приблизно$1.5 \mathrm{~nm}$ на частотах$Q$ -діапазону. Виникає межа на великі відстані, оскільки для виведення ширини або навіть форми розподілу відстані потрібно спостерігати кілька диполярних коливань, і для визначення середньої відстані потрібно спостерігати принаймні одне коливання. Для цього потрібно$t>2 \pi / d$. З іншого боку, у нас є$t<\tau_{2}$ і фіксована інтерпульсна затримка$\tau_{2}$ не може бути набагато довшою, ніж час поперечної релаксації$T_{2}$, оскільки в іншому випадку когерентність повністю розслаблена і відлуння не спостерігається. Час поперечної релаксації електронного спіна становить близько декількох мікросекунд. Залежно від типу вибірки (див. Розділ$9.1 .2$),$\tau_{2}$ можуть бути$1.5$ обрані між і$20 \mu \mathrm{s}$, що відповідають максимальним спостережуваним відстаням між 5 і$12 \mathrm{~nm}$.

Вимоги до зразків

У бажаному шляху передачі когерентності експерименту DEER імпульси спостерігача виключно збуджують спини спостерігача, а імпульс насоса виключно збуджує партнера зчеплення. Смуга пропускання збудження повинна бути досить великою, щоб охоплювати дипольно-дипольну муфту$d$ на всіх орієнтаціях, тобто більше, ніж$\omega_{\|}-2 \omega_{\perp}$. Якщо два з'єднані спини мають однаковий спектр ЕПР, цей спектр повинен бути ширшим, ніж удвічі перевищує мінімальну пропускну здатність збудження. Ця умова виконується для нітроксидних спінових міток (Глава 10) та іонів перехідних металів на всіх частотах EPR, тоді як деякі органічні радикали, такі як тритилові радикали, мають занадто вузькі спектри на частотах X-діапазону або навіть Q-діапазону. Крім того,$T_{2}$ повинен бути досить довгим, щоб принаймні спостерігач обертався. Ця умова може бути виконана майже для всіх$S=1 / 2$ видів при температурах$10 \mathrm{~K}$ (комплекси перехідних металів) або$50 \cdots 80 \mathrm{~K}$ (органічні радикали), але може вимагати охолодження нижче$4.2 \mathrm{~K}$ для деяких видів з високим спіном. Для високошвидкісних видів з напівзаповненою валентною оболонкою, таких як Mn (II)$(S=5 / 2)$ або$\mathrm{Gd}(\mathrm{III})(S=7 / 2)$$10 \mathrm{~K}$ вимірювальні температури також достатні.

Концентрація зразка повинна бути досить низькою, щоб міжмолекулярні відстані були набагато більшими за внутрішньомолекулярні відстані. Для коротких відстаней$200 \mu \mathrm{M}$ можливі концентрації до, але концентрації$10 \cdots 50 \mu \mathrm{M}$ забезпечують кращі результати, якщо спектрометр з достатньою чутливістю доступний. Залежно від відстані і$T_{2}$, вимірювання можуть бути виконані аж до концентрації$10 \cdots 1 \mu \mathrm{M}$. Для мембранних білків, відновлених у ліпосоми, якість даних є не тільки функцією об'ємної концентрації спина, але і співвідношення ліпідів до білка. Цей параметр потрібно оптимізувати під кожен новий білок. Необхідний обсяг вибірки коливається між кількома мікролітрами (частоти W-діапазону) і$150 \mu \mathrm{L}$$50 \mu \mathrm{L}$ при частотах Q-діапазону, як правило, є оптимальними.

Якщо концентрація не надто висока і може бути досягнута низькотемпературна межа поперечної релаксації,$T_{2}$ залежить від концентрації та типу протонів навколо спіна спостерігача. Повторення розчинника і кріопротектора (зазвичай гліцерину) зазвичай різко покращують якість даних. Якщо матриця може бути пердейтрована, дейтерація білка або ядер кислоти може ще більше продовжити$T_{2}$ і розширити діапазон відстані або поліпшити співвідношення сигнал/шум.

Ускладнення виникають, якщо в одній молекулі виявлено більше двох непарних електронів, але ці ускладнення зазвичай можна вирішити. Однак жодна з спінових пар не повинна мати відстань, меншу за нижню межу доступного діапазону відстані.

---

¹ Це передбачає, що$\pi$ імпульс спостерігача має фазу$y$. Якщо він має фазу$x$, вектор намагніченості знаходиться уздовж\(+y\) після першої перефокусування і всі наступні панелі намагніченості дзеркальні щодо\(x\) осі.