9.7: Структура платино-ДНК комплексів
- Page ID
- 20117
a. дослідження ЯМР платинованих олігонуклеотидів
Після того, як почав з'являтися основний спектр аддуктів, утворених цис - і транс-DDP з ДНК, було безпосередній інтерес дізнатися, з якими позиціями на нуклеобазах координувався атом платини. Протонна ЯМР-спектроскопія незабаром виявилася безцінним інструментом для отримання цієї інформації. 71,125,126 Синтезовано кілька рибо- і дезоксирибулігонуклеотидів, що містять послідовності GG, AG або GNG, і дозволили реагувати з цис-DDP або продуктами його гідролізу, а отримані комплекси очищені хроматографією. Усі олігомери, що містять GG, утворили внутрішньожильні зшивання з фрагментом {Pt (NH 3) 2} 2+, координованим з атомами N7. Ця структура була виведена з декількох критеріїв. Найбільш часто вивчалися необмінні базові протони H8 і H2 аденіну, H6 тиміну, H8 гуаніну та H5 та H6 цитозину (рис. 9.9). Координація платини до N7 гуаніну викликає зсув низхідного поля протонного резонансу H8. Що ще важливіше, однак, він також знижує pK a протона N1 на ~ 2 одиниці, оскільки платина додає позитивний заряд до основи. Таким чином, титрування платинованого олігонуклеотиду в діапазоні рН та порівняння результатів з результатами, отриманими для неплатинованого олігомеру, виявляють різницю в середній точці переходу хімічного зсуву протона Н8 на 2 одиниці рН, якщо координація відбувається при N7. Цей ефект проілюстрований на малюнку 9. 19 для аддукта cis - [Pt (NH 3) 2 {d (ApGPgPCPCPPT)} N7-G (2), N7-G (3)], де pK a N1, як видно, зміщується від ~ 10 до ~ 8 після платинації. 71 Титрування рН у цьому прикладі також виявляє pH-залежний хімічний зсув резонансів цитозину 1 Н при рН ~ 4,5, що відповідає протонації атомів N3. Протонування аденіну N7 (pK a ~ 4) також часто спостерігається в цих дослідженнях. Ці результати переконливо демонструють координацію платини при N7 двох гуанозидних нуклеозидів.
Хоча деякі досліджувані олігонуклеотиди мають самодоповнюючі послідовності, такі, що вони можуть утворювати подвійну спіраль при неплатинованих, ні в якому разі не спостерігався дуплекс для їх платинованих форм. Наявність індукованої платиною зшивання імовірно знижує стабільність двонитевої форми олігонуклеотиду. Іншим цікавим результатом є те, що всі внутрішньопрядні {Pt (NH 3) 2} 2+ аддукти d (GpG) або d (ApG) мають змінену конформацію дезоксирибозцукрового кільця. У нормальній, неплатинованій формі ці однониткові або дуплексні олігонуклеотиди мають цукровий тягач C2'-ендо (рис. 9.9). Після платинації 5'-нуклеотид перемикається на C3'-ендо. Ця зміна легко відстежується кільцевими протонними муфтами констант J H1'-H2' і J H1'-H2". Ці протони складають спінову систему ABX, таку, що сума,\(\Sigma\) 3 J = 3 J 1'2' + 3 J 1'2', найлегше вимірюється як поділ між крайніми піками в мультиплеті. Для конформації C2'-ендо псевдотриплет виникає з\(\Sigma\) 3 J = 13,6 Гц, а для C3'-ендо -\(\Sigma\) 3 J = 7.5 Гц. 3'-гуанозини в аддуктах демонструють більшу конформаційну гнучкість, маючи від ~ 70 до 80 відсотків C2'-ендо цукрових відтягувачів, залежно від температури.
Ще одна конформаційна особливість, яка може бути виведена з 1 H ЯМР досліджень всіх цис-DDP-платинованих олігонуклеотидів, що містять вбудовану послідовність d (GpG), полягає в тому, що обидва гуанозидні нуклеозиди зберігають анти орієнтацію основи навколо глікозидного зв'язку C1'-N9 (рис. 9.9). Цей результат був виведений з відсутності вираженого ефекту ядерного перекриття (NOE) між протонами H8 та H1 ', наприклад, у конформації синів. NOE між резонансами H8 на двох координованих нуклеозидах спостерігалося для аддуктів d (AptPgPG) та d (CpgPg), що вказує на те, що дві основи знаходяться в орієнтації голови до голови відносно платинової координаційної площини. Іншими словами, обидва атоми O6 лежать на одній стороні цієї площини. Були досліджені два олігонуклеотиди, що містять цис - [Pt (NH 3) 2 (ApG)] аддукти; їх структурні властивості дуже нагадують аддукти (GpG), причому платина узгоджена з N7 обох пуринових основ.
Для того щоб вивчити двожильні ДНК, платинові на одній нитці, необхідно було прийняти спеціальну стратегію. Спочатку синтезується потрібний олігонуклеотид. Бажано, щоб нитки ДНК не були самодоповнюючими, оскільки спорідненість такого олігомера для себе настільки більша, ніж для його платинованої форми, що бажаний, одноплатинний дуплекс не сформується. Після того як платинована одна пасмо синтезується і очищена, додається комплементарна пасмо. Кілька дуплексних олігонуклеотидів, що містять цис - [Pt (NH 3) 2 {d (PgPg)}] -вбудованих аддуктів, підготовлених таким чином, були вивчені методом 1-H ЯМР-спектроскопії. З використанням двовимірних і залежних від температури методів були досліджені як необмінні основи, так і протони цукру, а також обмінні (гуанін N1 і тимін N3) N-H (imino) протонні резонанси. Останні корисні, так як дають деяку міру того, наскільки подвійна спіраль залишається недоторканою. Коли вони не сполучені з їх доповненнями в іншій нитці, ці протони швидше обмінюються з протонами розчинника (води), що призводить при помірних обмінних курсах до розширення резонансів і, при високих обмінних курсах (>10 7 с -1), зникнення сигналів. У цих дослідженнях було отримано кілька цікавих результатів. У всіх них платинація послідовності d (GpG) принесла приблизно той самий C2'-ендо → C3'-ендо цукрово-кільцевий перемикач для 5'-гуанозин, як видно в одножильних аддуктах. Також спостерігалися анти конформації головою до голови. При низьких температурах, нижче температури переходу плавлення, вище якої дуплекс стає одножильним, спостерігалися іміно-протонні резонанси. Цей результат був інтерпретований як означає, що нормальні пари основи Уотсона-Крика все ще можуть існувати між cis -DDP d (GpG) аддуктом та послідовністю d (CPC) на додатковій нитці. У випадку [d (TpcPtPCPg* Pg* PTPCPtpPC)] • [d (GPPGPCpcPgPGPGPGPGPgpgpgpa)], де зірочки посилаються на місця платинування, іміно-протонні резонанси були призначені за допомогою експериментів NOE. 125 Температурно-залежні дослідження показали, що в діапазоні - 4° < T < 46° C спочатку іміно резонанси координованих гуанозиннуклеозидів розширилися з підвищенням температури. Мабуть, базові пари внутрішньониткової зшитої, платинованої дуплексної ДНК порушуються або «плавляться» назовні від точки платинації, а також з кінців. Оскільки атоми аміноводню, що беруть участь у сполученні основи, не спостерігалися в цьому дослідженні, повністю остаточний структурний аналіз був неможливий. Тим не менш, автори запропонували, що дуплекс буде згорнутий під кутом ~ 60° на сайті прив'язки cis -DDP з метою збереження повного дуплексного характеру.
Іншим корисним ядром ЯМР для моніторингу взаємодії цис-DDP-ДНК є 195 Pt, що на 34 відсотки рясніють I =\(\frac{1}{2}\). При використанні спільно з 15 N (I =\(\frac{1}{2}\)) збагаченими лігандами NH 3, резонанси ЯМР 195 Pt забезпечують потужний засіб для характеристики комплексів в розчині. Хімічні зсуви 195 Pt та 15 N чутливі до трансу ліганду до групи NH 3, як і постійна зчеплення 195 Pt- 15 N. 127 195 Pt ЯМР дослідження цис-DDP-зв'язування були проведені з використанням нуклеобаз, малих олігонуклеотидів і навіть дволанцюгових фрагментів довжиною від 20 до 40 б.п., як описано раніше (Розділ V.D.L). Основний внесок цього методу полягає в тому, щоб показати, чи платина координати азоту або атома донора кисню на ДНК, оскільки хімічний зсув 195 Pt чутливий до цієї різниці лігування.
b. рентгенівські структурні дослідження
В останні роки кілька олігонуклеотидних дуплексів були кристалізовані і характеризуються методами рентгенівської дифракції. Імовірність утворення відповідних монокристалів фрагментів ДНК невтішно низька, однак лише 1 з 10 таких спроб є успішним. Відповідно, було важко кристалізувати платиновані олігонуклеотиди. Альтернативним підходом було змочування кристалів нуклеїнової кислоти відомої структури платиновим реагентом в надії на формування ізоморфного похідного, структуру якого можна було б отримати, використовуючи зміни фаз з нативного матеріалу. У спробах охарактеризувати аддукт нуклеїнової кислоти цис-DDP кристали тРНК Phe і самокомплементарного додекамера d (cpgpgpgpppptppppcpgpgPCpg) просочувалися розчинами цисплатину в надії на отримання корисної метричної інформації. 123,128,129 Ці зусилля досі не змогли створити структуру з високою роздільною здатністю, хоча вони підтверджують схильність до того, щоб платина координувалася до положення пуринових кілець N7. Додавання цис-DDP має тенденцію до розладу кристала, при цьому платина йде на кілька ділянок часткової заповненості.
Більш плідним підходом було кристалізація очищеного олігонуклеотиду, що містить скоординований cis - {Pt (NH 3) 2} 2+ фрагмент. Першою рентгенівською структурою, яка була розшифрована за допомогою такої стратегії, була структура cis - [Pt (NH 3) 2 {d (PgPg)}]. 130 Ця сполука кристалізується з водним розчинником і молекулами буфера гліцину в решітці. Кристали вирощували при рН 3,8, де кінцевий фосфат монопротонується з метою забезпечення нейтрального комплексу зі зменшеною розчинністю. Отримано дві кристалічні форми, і обидві структури розв'язані, одна з роздільною здатністю 0,94 Å. Останній містить чотири кристалографічно незалежні молекули, які, хоча і ускладнюючи структуру розчину, надавали чотири незалежних погляди на основний аддукт, утворений цис -DDP з ДНК. Чотири молекули утворюють агрегат, утримуваний між собою водневим зв'язком і міжмолекулярними взаємодіями з укладанням основа-основа (рис. 9.20). Існує два конформаційно різних класи, які містять молекули 1 і 2, і молекули 3 і 4; всередині кожного класу молекули пов'язані приблизною віссю симетрії С 2.
Молекулярна структура молекули 1 відображена на малюнку 9.21; геометрична інформація про всіх чотирьох молекулах міститься в таблиці 9.4. Як і очікувалося з досліджень ЯМР, платинові координати до атомів N7 гуанінових основ, які повністю знищені (двогранні кути коливаються від 76,2 до 86,7°), утворюють квадратно-плоску геометрію. Основи мають конфігурацію «голова до голови» та конформаційні кути\(\chi\) (табл. 9.4 та рис. 9.9), які потрапляють в анти діапазон. Цукрові відсмоктувачі 5'-дезоксирибозних кілець для всіх чотирьох молекул мають конформацію C3'-ендо, а деякі атоми вуглецю 3'-цукру демонструють великі теплові параметри, що свідчать про менш впорядковану структуру. Ці результати надалі демонструють схожість структури, виявленої у твердому стані за допомогою рентгенівської дифракції та в розчині за допомогою ЯМР-спектроскопії.
Цікавою додатковою особливістю кристалічної структури cis - [Pt (NH 3) 2 {d (PgPg)}] є воднева зв'язкова взаємодія між аміновим лігандом і атомом кисню кінцевої фосфатної групи (OP1A•••N1, рис. 9.21). Цей внутрішньомолекулярний водневий зв'язок помітний у трьох з чотирьох молекул в асиметричній одиниці. Хоча актуальність цієї зв'язкової взаємодії водню до структури розчину та молекулярного механізму цисплатину в даний час невідома, цікаво відзначити, що протипухлинна активність галогенідних комплексів платинового аміну знижується, коли протони на координованому NH 3 замінюються алкілом. групи. 34
Другим цис-DDP-олігонуклеотидним аддуктом, що характеризується рентгенівською кристалографією, є нейтральна молекула cis - [Pt (NH 3) 2 {d (CpgPG)}]. 131 Тут знову є кілька (трьох) молекул в асиметричній одиниці. Хоча визначається при більш низькій роздільній здатності, структура більшою мірою схожа на структуру цис-[ Pt (NH 3) 2 {d (PgPg)}], за винятком наявності деяких слабких NH 3 •••O6 (гуанозин) внутрішньомолекулярних взаємодій водню і декількох незвичайних цукр-фосфат кути кручення хребта. Також не спостерігалося водневих зв'язків NH 3 (H) ••• фосфатних (O).
З вищевикладеного обговорення видно, що адекватна інформація про структуру рентгенівського випромінювання доступна для внутрішньожильного зшивання cis - {Pt (NH 3) 2} 2+/d (PgPg). Зараз потрібні структури незначних аддуктів і, що найголовніше, аддуктів у дволанцюговій ДНК. Зовсім недавно були кристалізовані додекануклеотидні дуплекси, що містять аддукти cis - {Pt (NH 3) 2} 2+ /d (PgPg), структури яких в даний час досліджуються. 132
c) Розрахунки молекулярної механіки на платинових дуплексах
Як доповнення до рентгенівської структурної інформації про дволанцюгові олігонуклеотиди, що містять вбудований cis - [Pt (NH 3) 2 {d (PgPg)}] аддукт, було побудовано кілька моделей з використанням підходу молекулярної механіки. 133 У цій роботі вперше отримано набір координат шляхом об'єднання структурної інформації про стандартні двоспіральні ДНК та платинований фрагмент d (PgPG). Приймалися різні стартові конструкції, як лінійні, так і зігнуті. Потім моделі були вдосконалені відповідно до різних зарядів та стереохімічних обмежень, вбудованих у розрахунок. Результати, які можуть виявити лише те, що можливо і не обов'язково те, що насправді відбувається, як для лінійних, так і для зігнутих структур зображені на малюнку 9.22 для двох досліджуваних дуплексних послідовностей. У лінійній моделі 5'-координований гуанозин обертається з стека, і його водневе зв'язування з цитозином на комплементарній пасма серйозно порушується. Однак група imino N-H все ще бере участь у H-зв'язуванні; тому ця структура не суперечить результатам ЯМР. Зустрічалися два класи зламаних платинованих дуплексних конструкцій з кутами вигину 61 і 50°. В одному з них все водневі зв'язки Уотсона-Крика залишаються недоторканими. Ці перегнуті структури найбільш сильно підтримуються експериментами з гель-електрофорезу, розглянутими в розділі V.D.3.b.V.
Молекулярна механіка та пов'язані з ними розрахунки молекулярної динаміки є потенційно цінним інструментом для біонеорганічного хіміка, зацікавленого в тому, як металеві комплекси можуть збурити структури біополімерів. Аналіз результатів зв'язування Cisplatin-DNA показує, що, порівняно з сумою всіх внесків біополімеру, взаємодії pt-ДНК складають невелику частину загальної енергії. Для отримання найбільш точних результатів важливо знати розподіл заряду на металі та його лігандах, а також наслідки взаємодії розчинників. Багато роботи потрібно зробити в цих областях, перш ніж результати молекулярної механіки та динамічних розрахунків можуть бути надійно використані для прогнозування або аналізу структур. В даний час, однак, вони набагато перевершують дослідження молекулярних моделей, що заповнюють простір, наприклад, і виробляють кількісно виявляючі структурні діаграми.
d. платино-нуклеобазові модельні комплекси
Було проведено кілька досліджень фрагмента цис-діаммінплатини (II), координованого з нуклеобазами, в яких позиції N9 (пурин) або N3 (піримідин) або були алкіліровані, для імітації глікозидних зв'язків, або в яких використовується фактичний нуклеотид (AMP, dGMP тощо). 134 Ці дослідження багато в чому аналогічні синтезу і характеристиці біонеорганічними хіміками модельних комплексів для активної ділянки металоферменту. Їх метою є спрощення задачі, виявлення кінетичних, тодінамічних і структурних переваг первинних будівельних блоків, що беруть участь у взаємодії металонаркотик-біополімер, без глибоких стереохімічних обмежень останнього. Ранні дослідження цис - і транс-DDP аддуктів з нуклеобазами (i) виявили кінетичні переваги для зв'язування платини з GMP і AMP, (ii) намітили бажані місця платинації (N7 A і G; N1 A; N3 C; немає N7-O6 хелат; відсутність рибози або дезоксирибози зв'язування; лише рідкісні зв'язування з фосфатними атомами кисню), (iii) продемонструвало, що зв'язування Pt-N7 з G знизило pK a N1-H на ~ 2 одиниці, і (iv) призвело до відкриття цікавих нових класів координаційних комплексів, таких як цис-діаммін-платиновий піримідиновий блюз і металево-металева зв'язана диплатина ( III) комплекси.
Спроби моделювати внутрішньоланцюгове зшивання d (GpG) з нуклеобазами мали лише помірний успіх. Зазвичай атоми O6 двох гуанозинових кілець знаходяться з протилежних сторін координаційної площини платини (ізомер «голова до хвоста»). Тільки для цис - [Pt (NH 3) 2 (9-etG) 2] 2+ був отриманий правильний ізомер. Нуклеобазові комплекси фрагменту цис-діаммінплатини (II) були цінними для тестування суперечливої пропозиції хелатного утворення N7, O6, яке до теперішнього часу не спостерігалося. Кілька цікавих відкриттів хімії метал-нуклеооснови полягають у тому, що зв'язування металів може стабілізувати рідкісні таутомери, наприклад, 4-іміно, 2-оксо-форму цитозину, через зв'язування N4, що координація платини часто спричиняє незвичайне сполучення основи, і що міграція металів від одного донорського місця до іншого на може виникнути ізольована нуклеобаза. Ці модельні дослідження продовжуватимуть надавати цінну інформацію про можливу хімію платинових протипухлинних препаратів з ДНК.
е. транс-DDP-ДНК аддукти
Оскільки транс-DDP біологічно неактивний, йому приділяється менше уваги, ніж цис-ізомер. Проте знання про його зв'язування з ДНК важливо мати як орієнтир для механістичного порівняння з активними сполуками. Незабаром після експериментів з відображення реплікації встановлено, що транс-DDP переважно зв'язується з послідовностями d (GpNPG) та d (ApNPG), 135 кілька синтетичних олігонуклеотидів, що містять такі послідовності, були підготовлені та використані для дослідження реакцій з транс-ізомером. 136-138 Кінетичні дослідження транс-DDP з d (GpCpG) і d (ApgPgPCPCPt) виявили наявність, імовірно, монофункціональних, проміжних продуктів, які закриті для утворення як внутрішньо-, так і міжланцюгових продуктів. У реакції з d (GpCpg) 1,3-внутрішньоланцюговий G-G хелат становив 70 відсотків продукту, а 21 відсоток решти матеріалу був нереагував олігонуклеотидом. Протонні дослідження ЯМР очищених транс - [Pt (NH 3) 2 {d (GpCpG)}], а також аналог d (GpTPG) встановили зв'язування платини з N7 позиціями двох транс-гуанозидних нуклеозидів. Як і у випадку з аддуктами cis - [Pt (NH 3) 2 {d (PgPg)}], залишок 5'-гуанозину більше не зберігав нормальну конформацію типу B-ДНК; натомість, витяжка цукрового кільця перейшла на C3'-ендо. Досить детальна характеристика ЯМР 1 Н транс - [Pt (NH 3) 2 {d (ApgPgPCPCPPT) -N7-A (1), N7-G (3)}] виявила дуже схожі риси. Цей приклад добре ілюструє різну стереоселективність цис-і транс-DDP зв'язування з ДНК. Ізомер цис утворює виключно внутрішньожильний d (GpG) зшивання, тоді як транс-ізомер робить 1,3-d (A* pgPg*) аддукт. Схематичне зображення транс - {Pt (NH 3) 2} 2+ аддукта показано на малюнку 9.23. Як видно, два пуринові кільця укладають велике, 23-членне кільце, центральний залишок гуанозину «випирає», а залишок 5'-має цукровий пакер C3'-ендо. Цю структуру можна порівняти з цис - [Pt (NH 3) 2 {d (PgPg)}] (рис. 9.21), де платина є частиною меншого 17-членного кільця. Як дослідження побудови моделі заповнення простору, так і розрахунки молекулярної механіки показують, що для транс-{ Pt (NH 3) 2} 2+ фрагмента було б стереохімічно дуже несприятливим для транс-{ Pt (NH 3) 2} 2+ для заміни аналога цис у внутрішньопрядному зшитому d (GpG) структура виду, показана на малюнку 9.21. Таким чином, для бідентатних аддуктів здається зрозумілим, що важлива відмінність між цис - і транс-DDP-зв'язуванням з однониткової ДНК виявляється структурами, показаними на рисунках 9.21 і 9.23 відповідно.
Інформація про транс-DDP-зв'язування з дволанцюговою ДНК мізерна, але дуже недавні дослідження показують, що транс - [Pt (NH 3) 2 {d (GPaPg) -N7-G (1), N7-G (3)}] внутрішньожильний зшитий фрагмент може бути вбудований в дуплексні додекамери. 139 Цікаво, що для однієї послідовності температура плавлення (T M) цього дуплексу не знижується порівняно з температурою незаплатинованого фрагмента ДНК, на відміну від результатів для cis -DDP внутрішньоланцюгових d (GpG) аддуктів. Цей інтригуючий результат, який погоджується з більш ранніми T M дослідженнями ДНК, платинованої транс-DDP, поки не має структурного обґрунтування. Це, можливо, має відношення до обробки біфункціональних транс-DDP-ДНК аддуктів in vivo.
f Вплив платинації на структуру ДНК
Цінно узагальнити на цьому етапі все, що було вивчено щодо змін у структурі ДНК, що відбуваються при цис-або транс-DDP-зв'язуванні. cis -DDP внутрішньониткові зшивання призводять до розпакування сусідніх основ і перемикання в цукровому витягуванні 5'-нуклеозиду від C2'-ендо, стандартної конформації B-ДНК, до C3'-ендо, конформації, що зустрічається в A-ДНК. Ці різні форми ДНК вже були введені в попередньому розділі. Спарювання бази Watson-Crick, хоча і ослаблене, ймовірно, підтримується. Докази того, що сполучення бази змінено, походять від досліджень з антинуклеозидними антитілами, які значно краще зв'язуються з ДНК, платинованої цис-DDP, ніж з немодифікованою ДНК. Ці антитіла розпізнають нуклеобази набагато краще в платинованій, ніж в неплатинованій ДНК, імовірно тому, що платинація порушує подвійну спіраль. Додаткова підтримка руйнування базової пари походить від експериментів градієнтної гель-денатурації з використанням спеціально платинованої ДНК (див. Розділ V.D.8.b). Внутрішньожильний зшивання cis -DDP також згинає спіраль приблизно на 34° і розмотує дуплекс на 13°. Коли транс-DDP утворює 1,3-внутрішньоланцюгові зшивання, нуклеотиди, розташовані між платинованими залишками, можуть бути опуклими; відповідно до цієї картини є той факт, що вони представляють особливо хорошу мішень для антинуклеозидних антитіл. У 1,3-внутрішньоланцюгових d (GpNPG) або d (APnPG) аддуктах 5'-нуклеозидний цукор змінений на C3 i-Endo. Формування внутрішньопрядного зшивання транс-DDP також призводить до згинання ДНК, але платина служить локусом шарнірного суглоба, а не для кооперативного згинання. Ці різні ефекти платинації на структуру ДНК, спричинені двома ізомерами, ймовірно, будуть пов'язані з їх різною біологічною діяльністю.