4.10: ESI-QTOF-MS, з'єднаний з ВЕРХ та його застосування для безпеки харчових продуктів

Last updated
Save as PDF

Page ID: 18692

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

ESI-QTOF-MS у поєднанні з ВЕРХ та його застосування для безпеки харчових продуктів

Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) - це дуже потужний метод поділу, який широко використовується в екологічній науці, фармацевтичній промисловості, біологічних та хімічних дослідженнях та інших галузях. Як правило, його можна використовувати для очищення, ідентифікації та/або кількісної оцінки одного або декількох компонентів у суміші одночасно.

Мас-спектрометрія (МС) - це метод виявлення шляхом вимірювання співвідношення маси до заряду іонних видів. Процедура складається з різних етапів. Спочатку в прилад вводять зразок, а потім випаровують. По-друге, види в зразку заряджаються певними іонізованими методами, такими як іонізація електронів (EI), електроспрей-іонізація (ESI), хімічна іонізація (CI), матрична лазерна десорбція/іонізація (MALDI). Нарешті, іонні види будуть проаналізовані залежно від їх співвідношення маси до заряду (м/ z) в аналізаторі, таких як квадруполь, час польоту (TOF), іонна пастка та перетворення Фур'є іонний циклотронний резонанс.

Мас-спектрометрична ідентифікація широко використовується разом з хроматографічним розділенням. Найбільш поширеними з них є газова хроматографія-мас-спектрометрія (ГК-МС) і рідинна хроматографія-мас-спектрометрія (LC-MS). Через високу чутливість, селективність та відносно низьку ціну GC-MS, він має дуже широке застосування у виявленні наркотиків, екологічному аналізі тощо. Для цих дослідницьких груп органічної хімії це також щоденне та зручне обладнання. Однак GC-MS неефективний, якщо молекули мають високу температуру кипіння і/або будуть розкладатися при високій температурі.

У цьому модулі ми в основному поговоримо про рідинної хроматографії та електроспрей іонізації квадрупольної мас-спектрометрії часу польоту (LC/ESI-QTOF-MS). Як згадувалося вище, LC має ефективну здатність розділення і MS має високу чутливість і сильну здатність структурної характеристики. Крім того, TOF-MS має кілька відмінних властивостей на вершині звичайних MS, включаючи швидку швидкість збору, високу точність масових вимірювань та великий діапазон мас. Поєднання LC і ESI-TOF-MS дозволяють отримати потужний в кількісному і якісному аналізі молекул в складних матрицях шляхом зменшення матричних перешкод. Це може відігравати важливу роль у сфері безпеки харчових продуктів.

Як це працює

Як правило, LC-MS має чотири компоненти, включаючи автопробовідбірник, ВЕРХ, джерело іонізації та мас-спектрометр, як показано на малюнку\(\PageIndex{1}\). Тут потрібно звернути увагу на інтерфейс ВЕРХ і МС, щоб вони могли підходити один до одного і бути з'єднаними. Існують зазначені розділові колони для ВЭЖХ-МС, внутрішній діаметр якої (ІД) зазвичай становить 2,0 мм. А витрата, яка становить 0,05 - 0,2 мл/хв, повільніше, ніж типова ВЕРХ. Для рухливої фази використовуємо комбінацію води і метанолу і/ацетонітрилу. І оскільки іони будуть гальмувати сигнали в МС, якщо ми хочемо змінити на рухливу фазу, модифікатор повинен бути летючим, наприклад, HCO ₂ H, CH ₃ CO ₂ H, [NH ₄] [HCO ₂] і [NH ₄] [CH ₃ CO ₂].

\(\PageIndex{1}\)Малюнок Компонент системи HPCL-MS. Адаптовано з WA. Корфмахер, *Drug Discov.* Сьогодні, 2005, 10, 1357.

Як інтерфейс між ВЕРХ та MS, джерело іонізації також має важливе значення. Існує багато типів і ESI і атмосферного тиску хімічної іонізації (APCI) є найбільш поширеними з них. Обидва вони працюють при атмосферному тиску, високій напрузі і високій температурі. У ESI колонка елюентна як розпилена в полі високої напруги (3 - 5 кВ). Тоді залишиться дуже маленька заряджена крапелька. Нарешті окремі іони утворюються в цьому процесі і переходять в мас-спектрометр.

Порівняння ESI-QTOF-MS та інших методів мас-спектрометра

Існує багато типів мас-спектрометрів, які можуть з'єднуватися з ВЕРХ. Однією з найбільш широко використовуваних систем МС є один квадрупольний мас-спектрометр, якийкоштує не дуже дорого, показано на рис\(\PageIndex{2}\). Ця система має два режими. Одним з режимів є загальний іонний моніторинг (TIM) режим, який може забезпечити загальний іонний хроматограф. Інший обраний режим моніторингу іонів (SIM), в якому користувач може вибрати для моніторингу деяких конкретних іонів, а чутливість останнього набагато вище, ніж перший. далі, масова роздільна здатність одного квадрупольного мас-спектрометра становить 1 Da і його найбільший діапазон виявлення маси 30 - 3000 Дн.

Малюнок\(\PageIndex{2}\) Одномісний квадрупольний мас-спектрометр. Адаптовано з W. A. Korfmacher, *використовуючи мас-спектрометрію для досліджень метаболізму наркотиків*, ^1-е видання, Тейлор і Френсіс, Абінгдон (2004).

Друга система MS - потрійна квадрупольная система MS-MS, показана на рис\(\PageIndex{3}\). Використовуючи цю систему, люди можуть вибрати деякі іони, звані батьківськими іонами, і використовувати інший електронний промінь, щоб знову зіткнутися з ними, щоб отримати фрагментарні іони, звані дочірніми іонами. Іншими словами, є два кроки для вибору молекул мішені. Таким чином, це значно зменшує ефект матриці. Ця система дуже корисна при аналізі біологічних зразків, оскільки біологічні зразки завжди мають дуже складну матрицю; однак масова роздільна здатність все ще становить 1 Да.

Малюнок\(\PageIndex{3}\) Потрійний квадрупольний мас-спектрометр. Адаптовано з W. A. Korfmacher, *використовуючи мас-спектрометрію для досліджень метаболізму наркотиків*, ^1-е видання, Тейлор і Френсіс, Абінгдон (2004).

Третя система - це час польоту (TOF) MS, показана на малюнку\(\PageIndex{4}\), яка може забезпечити більш високий спектр масової роздільної здатності, від 3 до 4 десяткових знаків Da. Крім того, він може виявляти дуже великий діапазон маси з дуже швидкою швидкістю. Найбільший діапазон виявлення маси становить 20 - 10000 Да. Але ціна такого виду МС дуже висока. Остання методика - це гібридний мас-спектрометр Q-TOF MS, який поєднує в собі один квадрупольний MS і TOF MS. Використовуючи цей MS, ми можемо отримати хроматограф з високою роздільною здатністю, а також ми можемо використовувати систему MS-MS для ідентифікації цільових молекул.

\(\PageIndex{4}\)Малюнок Час польоту мас-спектрометр. Адаптовано від В.А. Корфмахера, *використовуючи мас-спектрометрію для досліджень метаболізму наркотиків*, 1-е видання, Тейлор і Френсіс, 2004.

Застосування LC/ESI-QTOF-MS при виявленні хінолонів у їстівній тваринній їжі

Хінолони - це сімейство поширених антибактеріальних ветеринарних препаратів, які можуть інгібувати ДНК-гіразу в бактеріальних клітині. Однак залишки хінолону в їстівних продуктах тваринного походження можуть бути безпосередньо токсичними або викликати стійкі патогени у людини. Тому необхідні чутливі методи для контролю таких залишків, які можуть бути присутніми в різних продуктах, що виробляють тварин, таких як яйце, курка, молоко та риба. Молекулярні структури восьми хінолонів, ципрофлоксацин (CIP), анофлоксацин метансульфонат (DAN), енрофлоксацин (ENR), дифлоксацин (DIF), сарафлоксацин (SARA), оксолінова кислота (ОКСО), флумехін (FLU), офлоксацин (OFL), наведені на рис\(\PageIndex{5}\).

\(\PageIndex{5}\)Малюнок Молекулярна структура восьми хінолонів. Адаптовано з М.М. Чжен, Г. Д. Руан, і Ю.К. Фен, *J. хроматор.* А, 2009, **1216**, 7510.

LC-MS є загальним підходом виявлення в області безпеки харчових продуктів. Але через складну матрицю зразків завжди важко виявити ці молекули-мішені низької концентрації за допомогою одного квадрупольного MS. Нижче наведено приклад застосування LC/ESI-QTOF-MS.

Використовуючи четвертинну насосну систему, систему Q-TOF-MS, колонку C18 (250 мм × 2,0 мм ІД, 5 мкм) зі швидкістю потоку 0,2 мл/хв, а також суміш розчинників як рухому фазу, що складається з 0,3% розчину мурашиної кислоти та ацетонітрилу. Градієнтний фофіл для рухомої фази наведено в табл\(\PageIndex{1}\). Оскільки в кислому стані pH хінолони несли позитивний заряд, всі масові спектри були придбані в режимі позитивних іонів і підсумовують 30 000 одиночних спектрів в діапазоні мас 100-500 Да.

Таблиця\(\PageIndex{1}\) Градієнтний фофіл для рухомої фази
Час (хв)	Об'єм% розчину мурашиної кислоти	Обсяг% ацетонітрилу
0	80	20
12	65	35
15	20	80
20	15	85
30	15	85
30.01	80	20

Оптимальними робочими параметрами джерела іонізації були наступні: капілярна напруга 4,5 кВ; енергія іонів квадруполя 5 еВ/з; температура сухого повітря 200 °С; небулайзер 1,2 бар; сухий газ 6,0 л/хв. В ході експериментів для зовнішньої калібрування приладу використовувався HCO ₂ Na (62 Da). Через високу точність маси мас-спектрометра TOF він може надзвичайно зменшити матричні ефекти. Три різних хроматографа показані на малюнку\(\PageIndex{6}\). Верхній - загальний іонний хроматограф в діапазоні вікон 400 Da. Відрізнити молекули мішені в цьому хроматографі неможливо. Середній знаходиться в одному дозволі Da, що є роздільною здатністю одного квадрупольного мас-спектрометра. У цьому хроматографі можна ідентифікувати деякі молекули. Але інтенсивність шуму все ще дуже висока, і в хроматографі є кілька піків домішок з аналогічними співвідношеннями маси до заряду. Нижня - з роздільною здатністю 0.01 Da. Він чітко показує піки восьми хінолонів з дуже високим співвідношенням сигнал/шум. Іншими словами, завдяки швидкій швидкості збору та високій точності маси, LC/TOF-MS може значно зменшити ефекти матриці.

Малюнок\(\PageIndex{6}\) Різні хроматографи 4 нг/г вісім хінолонів шипами в зразках риби з різною масовою роздільною здатністю. Піки: 1 = ОФЛ; 2 = СИП; 3 = ДАН; 4 = ЕНР; 5 = САРА; 6 = ДІФ; 7 = ОКСО; 8 = ГРИП. Адаптовано з М.М. Чжен, Г. Д. Руан, і Ю.К. Фен, *J. хроматор.* А, 2009, **1216**, 7510.

Квадрупольний МС може бути використаний для подальшого підтвердження молекул мішені. \(\PageIndex{7}\)На малюнку показані хроматограми, отримані при підтвердженні CIP (17,1 нг/г) у позитивній пробі молока та ENR (7,5 нг/г) у позитивній пробі риби. Хроматографи батьківських іонів показані з лівого боку. З правого боку вони є характерними дочірніми іонними масовими спектрами CIP і ENR.

Рис.\(\PageIndex{7}\) Хроматограми, отримані в підтвердженні CIP (17,1 нг/г) у позитивній пробі молока та ENR (7,5 нг/г) у позитивній пробі риби. Адаптовано з М.М. Чжен, Г. Д. Руан, і Ю.К. Фен, *J. хроматор.* А, 2009, **1216**, 7510.

Недоліки ЖК/Q-TOF-MS

Деякі з недоліків LC/Q-TOF-MS - це його високі витрати на придбання та обслуговування. Важко застосовувати цей метод при щоденному виявленні в області охорони навколишнього середовища та безпеки харчових продуктів.

Для того, щоб зменшити ефект матриці та покращити чутливість виявлення, люди можуть використовувати деякі методи підготовки зразків, такі як екстракція рідина-рідина (LLE), твердофазна екстракція (SPE), дистиляція. Але ці методи споживають велику кількість зразків, органічного розчинника, часу та зусиль. У наш час з'являються нові методи підготовки зразків. Наприклад, люди можуть використовувати онлайн-мікродіаліз, екстракцію надкритичної рідини (SFE) та екстракцію рідини під тиском. У методі, згаданому в частині програми, ми використовуємо онлайн-твердофазну мікроекстракцію в трубці (SPME), яка є чудовою технікою підготовки зразків з особливостями невеликого обсягу зразка, простоти екстракції без розчинників та легкої автоматизації.