9.1: Як ростуть мікроби

Цілі навчання

• Визначте час генерації для зростання на основі бінарного поділу
• Визначте та опишіть діяльність мікроорганізмів, що проходять типові фази бінарного поділу (простого поділу клітин) у кривій росту
• Поясніть кілька лабораторних методів, що використовуються для визначення життєздатних та загальної кількості клітин у популяціях, що переживають експоненціальний ріст
• Опишіть приклади поділу клітин, не пов'язаного з двійковим поділом, наприклад, бутонізація або фрагментація
• Охарактеризуйте формування та характеристики біоплівок
• Визначте ризики для здоров'я, пов'язані з біоплівками, та способи їх вирішення
• Охарактеризуйте зондування кворуму та його роль у зв'язку між клітинами та координації клітинної діяльності

Клінічна спрямованість: Частина 1

Дженні, 24-річна вагітна жінка у другому триместрі, відвідує клініку зі скаргами на високу температуру, 38,9° C (102° F), втому та м'язові болі - типові грипоподібні ознаки та симптоми. Jeni регулярно займається і дотримується поживної дієти з акцентом на органічні продукти, включаючи сире молоко, яке вона купує на місцевому фермерському ринку. Всі її щеплення актуальні. Однак постачальник медичних послуг, який бачить Джені, стурбований і замовляє зразок крові, який буде відправлений на тестування в лабораторію мікробіології.

Вправа\(\PageIndex{1}\)

Чому медичний працівник стурбований ознаками та симптомами Дженні?

Бактеріальний клітинний цикл передбачає утворення нових клітин шляхом реплікації ДНК і поділу клітинних компонентів на дві дочірні клітини. У прокаріотів розмноження завжди безстатеве, хоча відбувається обширна генетична рекомбінація у вигляді горизонтального перенесення генів, як буде вивчено в іншому розділі. Більшість бактерій мають єдину кругову хромосому; однак існують деякі винятки. Наприклад, Borrelia burgdorferi, збудник хвороби Лайма, має лінійну хромосому.

Двійковий поділ

Найпоширенішим механізмом реплікації клітин у бактерій є процес, званий бінарним діленням, який зображений на малюнку\(\PageIndex{1}\):. Перед поділом клітина розростається і збільшує свою кількість клітинних компонентів. Далі реплікація ДНК починається в місці на круговій хромосомі, яка називається походженням реплікації, де хромосома прикріплена до внутрішньої клітинної мембрани. Реплікація триває в протилежних напрямках уздовж хромосоми, поки не буде досягнута кінцева частина.

Малюнок\(\PageIndex{1}\): (а) Електронна мікрофотографія зображує дві клітини Salmonella typhimurium після події двійкового поділу. (b) Бінарне поділ у бактерій починається з реплікації ДНК, коли клітини подовжуються. У центрі клітини утворюється розділова перегородка. Дві дочірні клітини подібного розміру утворюють і відокремлюються, кожна з яких отримує копію вихідної хромосоми. (кредит а: модифікація роботи Центрів контролю та профілактики захворювань).

Центр збільшеної клітини звужується до утворення двох дочірніх клітин, кожне потомство отримує повну копію батьківського генома і поділ цитоплазми (цитокінез). Цим процесом цитокінезу і поділу клітин керує білок під назвою FtSZ. FTsZ збирається в Z-кільце на цитоплазматичної мембрані (рис.\(\PageIndex{2}\)). Кільце Z закріплено білками, що зв'язують FTSZ, і визначає площину поділу між двома дочірніми клітинами. Додаткові білки, необхідні для поділу клітин, додаються в кільце Z, щоб утворити структуру, звану дільсомою. Дивісома активується, щоб виробляти клітинну стінку пептидоглікану і побудувати перегородку, яка розділяє дві дочірні клітини. Дочірні клітини відокремлюються перегородкою поділу, де всі зовнішні шари клітин (клітинна стінка і зовнішні мембрани, якщо вони є) повинні бути реконструйовані до повного поділу. Наприклад, ми знаємо, що специфічні ферменти розривають зв'язки між мономерами в пептидогліканах і дозволяють додавати нові субодиниці уздовж перегородки поділу.

Малюнок\(\PageIndex{2}\): Білки FtSz збираються, утворюючи Z-кільце, яке закріплено на плазматичній мембрані. Кільце Z затискає оболонку клітини, щоб відокремити цитоплазму нових клітин.

Вправа\(\PageIndex{2}\)

Як називається білок, який збирається в кільце Z, щоб ініціювати цитокінез і поділ клітин?

Час генерації

У еукаріотичних організмів час генерації - це час між однаковими точками життєвого циклу в двох послідовних поколіннях. Наприклад, типовий час генерації для людського населення становить 25 років. Це визначення не є практичним для бактерій, які можуть швидко розмножуватися або залишатися в стані спокою протягом тисяч років. У прокаріотів (Бактерії та Археї) час генерації також називається часом подвоєння і визначається як час, необхідний для того, щоб популяція подвоїлася через один раунд бінарного поділу. Бактеріальні рази подвоєння надзвичайно різняться. У той час як кишкова паличка може подвоїтися всього за 20 хвилин при оптимальних умовах росту в лабораторії, бактеріям того ж виду може знадобитися кілька днів, щоб подвоїтися в особливо суворих умовах. Більшість збудників швидко ростуть, як і кишкова паличка, але бувають і винятки. Наприклад, Mycobacterium tuberculosis, збудник туберкульозу, має час генерації від 15 до 20 годин. З іншого боку, M. leprae, що викликає хворобу Хансена (проказу), росте набагато повільніше, з часом подвоєння 14 днів.

Обчислення кількості клітинок

Можна передбачити кількість клітин в популяції, коли вони діляться бінарним поділом з постійною швидкістю. Як приклад розглянемо, що станеться, якщо одна клітина ділиться кожні 30 хвилин протягом 24 годин. Діаграма на малюнку\(\PageIndex{3}\) показує збільшення кількості клітин за перші три покоління.

Кількість клітин зростає експоненціально і може виражатися як 2 ⁿ, де n - кількість поколінь. Якби клітини діляться кожні 30 хвилин, через 24 години відбулося б 48 поділів. Якщо застосувати формулу 2 ⁿ, де n дорівнює 48, то одна комірка призведе до 2 ⁴⁸ або 281 474,976 710,656 клітин при 48 поколіннях (24 години). При роботі з такими величезними числами практичніше використовувати наукові позначення. Тому виражаємо кількість осередків як 2,8 × 10 ¹⁴ осередків.

У нашому прикладі ми використовували одну клітинку як початкову кількість клітин. Для будь-якої кількості стартових осередків формула адаптована наступним чином:

\[N_n = N_02^n\]

N _n - кількість клітин у будь-якому поколінні n, N ₀ - початкова кількість клітин, а n - кількість поколінь.

Малюнок\(\PageIndex{3}\): Батьківська клітина ділиться і дає початок двом дочірнім клітинам. Кожна з дочірніх клітин, в свою чергу, ділиться, даючи в цілому чотири клітини другого покоління і вісім клітин в третьому поколінні. Кожне поділ подвоює кількість клітин.

Вправа\(\PageIndex{3}\)

З подвоєнням часу 30 хвилин і стартовим розміром населення 1 × 10 ⁵ клітин, скільки клітин буде присутній через 2 години, припускаючи відсутність загибелі клітин?

Крива зростання

Мікроорганізми, вирощені в закритій культурі (також відома як культура партії), в якій не додаються поживні речовини і більшість відходів не видаляються, дотримуються відтворюваної моделі росту, яка називається кривою росту. Прикладом періодичної культури в природі є ставок, в якому в закритому середовищі росте невелика кількість клітин. Щільність культури визначається як кількість клітин на одиницю об'єму. У закритому середовищі щільність культури також є мірою кількості клітин в популяції. Інфекції організму не завжди слідують кривій росту, але кореляції можуть існувати залежно від місця та типу інфекції. Коли кількість живих клітин побудовано проти часу, на кривій можна спостерігати різні фази (рис.\(\PageIndex{4}\)).

Малюнок\(\PageIndex{4}\): Крива росту бактеріальної культури представлена логарифмом кількості живих клітин, побудованих як функція часу. Графік можна розділити на чотири фази відповідно до нахилу, кожна з яких відповідає подіям в комірці. Чотири фази - відставання, колода, стаціонарна та смерть.

Фаза відставання

Початок кривої росту являє собою невелику кількість клітин, які називаються інокулятом, які додаються до свіжого середовища культури, поживного бульйону, який підтримує ріст. Початкова фаза кривої зростання називається лаг-фазою, під час якої клітини готуються до наступної фази зростання. Кількість клітин не змінюється під час фази відставання; однак клітини збільшуються і метаболічно активні, синтезуючи білки, необхідні для зростання в середовищі. Якщо будь-які клітини були пошкоджені або шоковані під час перенесення на новий носій, ремонт відбувається під час фази відставання. Тривалість лаг-фази визначається багатьма факторами, включаючи видовий і генетичний склад клітин, склад середовища, розмір вихідного інокулята.

Фаза журналу

У логарифмічній (log) фазі росту, яку іноді називають експоненціальною фазою росту, клітини активно діляться двійковим поділом і їх кількість збільшується в геометричній прогресії. Для будь-якого даного виду бактерій час генерації в конкретних умовах росту (поживні речовини, температура, рН тощо) визначається генетично, і цей час генерації називається внутрішньою швидкістю росту. Під час фази журналу зв'язок між часом і кількістю комірок не лінійний, а експоненціальний; однак крива зростання часто будується на семілогарифмічному графіку, як показано на малюнку\(\PageIndex{5}\), що дає вигляд лінійної залежності.

Рисунок\(\PageIndex{5}\): Обидва графіки ілюструють зростання популяції під час фази журналу для зразка бактерій з початковою популяцією однієї клітини та часом подвоєння 1 годину. (а) При нанесенні на арифметичну шкалу швидкість росту нагадує криву. (b) При нанесенні на семілогарифмічну шкалу (тобто значення на осі y є логарифмічними), швидкість росту виглядає лінійною.

Клітини в фазі журналу показують постійну швидкість росту і рівномірну метаболічну активність. З цієї причини клітини у фазі журналу переважно використовуються для промислових застосувань та науково-дослідних робіт. Фаза журналу - це також стадія, коли бактерії найбільш сприйнятливі до дії дезінфікуючих засобів та поширених антибіотиків, які впливають на синтез білка, ДНК та клітинної стінки.

Стаціонарна фаза

У міру збільшення кількості клітин через фазу колод кілька факторів сприяють уповільненню швидкості росту. Продукти життєдіяльності накопичуються і поживні речовини поступово витрачаються. Крім того, поступове виснаження кисню починає обмежувати аеробний ріст клітин. Таке поєднання несприятливих умов уповільнює і остаточно зупиняє зростання населення. Загальна кількість живих клітин досягає плато, іменованого стаціонарною фазою (рис.\(\PageIndex{4}\)). У цій фазі кількість нових клітин, створених діленням клітин, тепер еквівалентна кількості клітин, що вмирають; таким чином, загальна популяція живих клітин відносно застійна. Щільність культури в стаціонарній культурі постійна. Несуча здатність культури, або максимальна щільність культури, залежить від типів мікроорганізмів у культурі та конкретних умов культури, однак несуча здатність є постійною для даного організму, вирощеного в тих же умовах.

Під час стаціонарної фази клітини переходять на режим виживання обміну речовин. Як зростання сповільнюється, так і синтез пептидогліканів, білків і нуклеїнових кислот; таким чином, стаціонарні культури менш сприйнятливі до антибіотиків, які порушують ці процеси. У бактерій, здатних виробляти ендоспори, багато клітин піддаються спорокуляції під час стаціонарної фази. Вторинні метаболіти, в тому числі антибіотики, синтезуються в стаціонарній фазі. У деяких патогенних бактерій стаціонарна фаза також пов'язана з експресією факторів вірулентності, продуктів, які сприяють здатності мікроба виживати, розмножуватися і викликати захворювання в організмі господаря. Наприклад, зондування кворуму в Staphylococcus aureus ініціює вироблення ферментів, які можуть руйнувати тканини людини та клітинні сміття, очищаючи шлях для бактерій, щоб поширитися в нову тканину, де поживних речовин більш багато.

Фаза смерті

Оскільки середовище культури накопичує токсичні відходи і вичерпуються поживні речовини, клітини гинуть у більшій і більшій кількості. Незабаром кількість відмираючих клітин перевищує кількість ділилися клітин, що призводить до експоненціального зменшення кількості клітин (рис.\(\PageIndex{4}\)). Це влучно названа фаза смерті, яку іноді називають фазою занепаду. Багато клітин лізують і виділяють поживні речовини в середовище, дозволяючи вижили клітинам підтримувати життєздатність і утворювати ендоспори. Кілька клітин, так званих персистерів, характеризуються повільною швидкістю обміну речовин. Клітини персистера мають медичне значення, оскільки вони пов'язані з певними хронічними інфекціями, такими як туберкульоз, які не реагують на лікування антибіотиками.

Підтримка мікробного росту

Схема росту, показана на малюнку,\(\PageIndex{4}\) відбувається в закритому середовищі; поживні речовини не додаються, а відходи і мертві клітини не видаляються. Однак у багатьох випадках вигідно підтримувати клітини в логарифмічній фазі росту. Один із прикладів - у галузях, які збирають мікробну продукцію. Чемостат (рис.\(\PageIndex{6}\)) використовується для підтримки безперервної культури, в якій поживні речовини надходять зі стійкою швидкістю. Контрольована кількість повітря змішується для аеробних процесів. Бактеріальна суспензія видаляється з тією ж швидкістю, що і поживні речовини надходять для підтримки оптимального середовища росту.

Малюнок\(\PageIndex{6}\): Чемостат - це посудина для культури, обладнана отвором для додавання поживних речовин (корму) та вихідним отвором для видалення вмісту (стоків), ефективно розріджуючи токсичні відходи та мертві клітини. Додавання і видалення рідин регулюють для підтримки культури в логарифмічній фазі росту. Якщо вирощуються аеробні бактерії, підтримується відповідний рівень кисню.

Вправа\(\PageIndex{4}\)

1. Під час якої фази зростання відбувається найшвидшими темпами?
2. Назвіть два фактори, що обмежують ріст мікробів.

Вимірювання росту бактерій

Оцінка кількості бактеріальних клітин у зразку, відомому як кількість бактерій, є загальним завданням, яке виконують мікробіологи. Кількість бактерій в клінічній пробі служить показником ступеня інфекції. Контроль якості питної води, продуктів харчування, ліків і навіть косметики спирається на оцінки кількості бактерій для виявлення забруднення та запобігання поширенню захворювання. Для вимірювання числа осередків використовуються два основних підходи. Прямі методи передбачають підрахунок клітин, тоді як непрямі методи залежать від вимірювання присутності або активності клітин без фактичного підрахунку окремих клітин. Як прямі, так і непрямі методи мають переваги та недоліки для конкретних застосувань.

Прямий підрахунок клітин

Прямий підрахунок клітин відноситься до підрахунку клітин в рідкій культурі або колоній на тарілці. Це прямий спосіб оцінки того, скільки організмів присутній у зразку. Давайте розглянемо спочатку простий і швидкий метод, який вимагає тільки спеціалізованого слайда і складного мікроскопа.

Найпростішим способом підрахунку бактерій називається прямий мікроскопічний підрахунок клітин, який передбачає перенесення відомого обсягу культури на калібрований слайд і підрахунок клітин під світловим мікроскопом. Калібрований слайд називається камерою Петроффа-Хауссера (рис.\(\PageIndex{7}\)) і схожий на гемоцитометр, який використовується для підрахунку еритроцитів. Центральна площа лічильної камери протравлена на квадрати різного розміру. Зразок культуральної суспензії додають в камеру під кришкоюковзубом, який поміщають на певній висоті від поверхні сітки. Оцінити концентрацію клітин у вихідному зразку можна шляхом підрахунку окремих клітин в ряді квадратів і визначення обсягу спостережуваного зразка. Площа квадратів і висота, на якій розташовується кришка-ковзання, вказуються для камери. Концентрація повинна бути виправлена для розведення, якщо проба була розведена перед перерахуванням.

Малюнок\(\PageIndex{7}\): (а) Камера Petroff-Hausser - це спеціальний слайд, призначений для підрахунку бактеріальних клітин в виміряному обсязі зразка. Сітка травлюється на слайді, щоб полегшити точність підрахунку. (b) Ця діаграма ілюструє сітку камери Петрофа-Хауссера, яка складається з квадратів відомих областей. Збільшений вигляд показує квадрат, в межах якого підраховуються бактерії (еритроцити). Якщо ковзання кришки знаходиться на 0,2 мм над сіткою і квадрат має площу 0,04 мм ², то обсяг дорівнює 0,008 мм ³, або 0,000008 мл. Оскільки всередині квадрата знаходиться 10 клітин, щільність бактерій становить 10 клітин/0,000008 мл, що дорівнює 1 250 000 клітин/мл. (Кредит: модифікація роботи Джеффрі М. Vinocur)

Клітини в декількох маленьких квадратах необхідно порахувати і взяти середнє значення, щоб отримати достовірний вимір. Переваги камери полягають в тому, що метод простий у використанні, відносно швидкий і недорогий. З іншого боку, лічильна камера погано працює з розведеними культурами, оскільки може не вистачити клітин для підрахунку.

Використання лічильної камери не обов'язково дає точний підрахунок кількості живих клітин, оскільки не завжди можна розрізнити живі клітини, мертві клітини та сміття однакового розміру під мікроскопом. Однак недавно розроблені методики флуоресцентного фарбування дозволяють розрізняти життєздатні і мертві бактерії. Ці плями життєздатності (або живі плями) зв'язуються з нуклеїновими кислотами, але первинні і вторинні плями відрізняються своєю здатністю перетинати цитоплазматичну мембрану. Первинне пляма, яке флуоресцентує зеленим кольором, може проникати в інтактні цитоплазматичні мембрани, фарбуючи як живі, так і мертві клітини. Вторинне пляма, яке флуоресцентує червоним кольором, може забарвити клітину тільки в тому випадку, якщо цитоплазматична мембрана значно пошкоджена. Таким чином, живі клітини флуоресцентують зеленим кольором, оскільки вони поглинають лише зелену пляму, тоді як мертві клітини здаються червоними, оскільки червона пляма витісняє зелену пляму на їх нуклеїнових кислотах (рис.\(\PageIndex{8}\)).

Малюнок\(\PageIndex{8}\): Флуоресцентне фарбування може бути використано для диференціації між життєздатними та мертвими бактеріальними клітинами у зразку для цілей підрахунку. Життєздатні клітини забарвлюються в зелений колір, тоді як мертві клітини забарвлюються в червоний колір. (кредит: модифікація роботи Пансері С, Кунья С, Д'Алессандро Т, Сандрі М, Джаваресі Г, Мараччі М, Хунг КТ, Тампієрі А)

Інша методика використовує електронний пристрій підрахунку комірок (лічильник Coulter) для виявлення та підрахунку змін електричного опору в сольовому розчині. Скляна трубка з невеликим отвором занурюється в розчин електроліту. Перший електрод підвішений в скляній трубці. Другий електрод розташовується зовні трубки. Оскільки осередки витягуються через малий отвір у скляній трубці, вони коротко змінюють опір, виміряний між двома електродами, і зміна реєструється електронним датчиком (рис.\(\PageIndex{9}\)); кожна зміна опору являє собою комірку. Метод є швидким і точним у діапазоні концентрацій; однак, якщо культура занадто концентрована, більше однієї клітини можуть пройти через отвір в будь-який момент часу і перекосити результати. Цей метод також не розмежовує живі і мертві клітини.

Прямі підрахунки дають оцінку загальної кількості клітин у вибірці. Однак у багатьох ситуаціях важливо знати кількість живих, або життєздатних, клітин. Підрахунки живих клітин необхідні при оцінці ступеня інфекції, ефективності антимікробних сполук і медикаментів або зараження їжі та води.

Малюнок\(\PageIndex{9}\): Лічильник сошника - це електронний пристрій, який підраховує осередки. Він вимірює зміну опору в розчині електроліту, що відбувається, коли комірка проходить через невеликий отвір у внутрішній стінці контейнера. Детектор автоматично підраховує кількість осередків, що проходять через отвір. (кредит b: зміна роботи Національними інститутами охорони здоров'я)

Вправа\(\PageIndex{5}\)

1. Навіщо підраховувати кількість клітин у більш ніж одному квадраті в камері Петрофа-Хауссера, щоб оцінити номери клітин?
2. При методі фарбування життєздатності, чому мертві клітини з'являються червоними?

Підрахунок тарілок

Кількість життєздатних пластин, або просто кількість пластин, - це підрахунок життєздатних або живих клітин. Він заснований на принципі, що життєздатні клітини розмножуються і породжують видимі колонії при інкубації у відповідних для зразка умовах. Результати зазвичай виражаються як колонієутворюючі одиниці на мілілітр (КУО/мл), а не клітини на мілілітр, оскільки більше однієї клітини, можливо, приземлилися на одному місці, щоб породити одну колонію. Крім того, зразки бактерій, які ростуть у скупченнях або ланцюгах, важко розігнати, і одна колонія може представляти кілька клітин. Деякі клітини описуються як життєздатні, але некультурні і не утворюють колоній на твердих середовищах. З усіх цих причин кількість життєздатних пластин вважається низькою оцінкою фактичної кількості живих клітин. Ці обмеження не применшують корисності методу, який дає оцінки кількості живих бактерій.

Мікробіологи зазвичай зараховують пластини з 30-300 колоніями. Зразки із занадто малою кількістю <30) do not give statistically reliable numbers, and overcrowded plates (> колоній (300 колоній) ускладнюють точний підрахунок окремих колоній. Крім того, підрахунки в цьому діапазоні мінімізують випадки виникнення більш ніж однієї бактеріальної клітини, що утворюють одну колонію. Таким чином, розрахункова КУО наближається до істинної кількості живих бактерій в популяції.

Існує два загальних підходи до інокуляції пластин для життєздатних підрахунків: розливна плита та методи поширення пластини. Хоча остаточна процедура щеплення відрізняється між цими двома методами, обидва вони починаються з серійного розведення культури.

Послідовне розведення

Послідовне розведення культури є важливим першим кроком перед тим, як перейти або до розливної плити, або розкладати пластинчастий метод. Метою процесу серійного розведення є отримання пластин з КУО в діапазоні 30-300, і процес зазвичай включає кілька розведень кратними 10 для спрощення розрахунку. Кількість серійних розведень вибирають за попередньою оцінкою густоти культури. Малюнок\(\PageIndex{10}\) ілюструє метод послідовного розведення.

Малюнок\(\PageIndex{10}\): Послідовне розведення передбачає розведення фіксованого обсягу клітин, змішаних з розбавляючим розчином з використанням попереднього розведення в якості інокуляту. Результатом є розведення вихідної культури експоненціально зростаючим фактором. (кредит: модифікація роботи «Leberechtc» /Wikimedia Commons)

Фіксований об'єм вихідної культури, 1,0 мл, додають і ретельно перемішують з першим розбавляючим розчином пробірки, який містить 9,0 мл стерильного відвару. Цей крок являє собою коефіцієнт розведення 10, або 1:10, порівняно з вихідною культурою. З цього першого розведення виводиться такий же обсяг, 1,0 мл, і змішується зі свіжою пробіркою 9,0 мл розчину для розведення. Коефіцієнт розведення тепер становить 1:100 порівняно з початковою культурою. Цей процес триває до тих пір, поки не буде вироблена серія розведень, які дозволять скоротити потрібну концентрацію клітин для точного підрахунку. З кожної трубки зразок наноситься на тверде середовище, використовуючи або метод заливки пластини (рис.\(\PageIndex{11}\)), або метод розкидання пластини (рис.\(\PageIndex{12}\)). Пластинки інкубують до появи колоній. З кожного розведення зазвичай готують дві-три тарілки, а кількість колоній, підрахованих на кожній тарілці, усереднюється. У всіх випадках ретельне перемішування зразків з середовищем для розведення (для забезпечення випадкового розподілу клітин в пробірці) має першорядне значення для отримання достовірних результатів.

Рис.\(\PageIndex{11}\): При розливному пластинчастому способі підрахунку клітин зразок змішують в рідкому теплому агарі (45—50 °С), виливають в стерильну чашку Петрі і далі перемішують шляхом закручування. Цей процес повторюють для кожного підготовленого серійного розведення. Отримані колонії підраховують і дають оцінку кількості осередків в початковому обсязі відібраних.

Коефіцієнт розведення використовується для обчислення кількості клітин у вихідній культурі клітин. У нашому прикладі на пластинках, отриманих від розведення 1:10 000, підраховувалося в середньому 50 колоній. Оскільки лише 0,1 мл суспензії був нанесений піпеткою на тарілку, множник, необхідний для відновлення початкової концентрації, становить 10 × 10 000. Кількість КУО на мл дорівнює 50 × 100 × 10000 = 5 000 000. Кількість бактерій в культурі оцінюється як 5 млн клітин/мл. Кількість колоній, отримана від розведення 1:1000, становила 389, що значно нижче очікуваних 500 для 10-кратної різниці в розведеннях. Це підкреслює проблему неточності, коли кількість колоній перевищує 300 і більше однієї бактеріальної клітини виростає в одну колонію.

Малюнок\(\PageIndex{12}\): У методі підрахунку клітин розкидних пластин зразок виливають на твердий агар, а потім поширюють за допомогою стерильного розкидача. Цей процес повторюють для кожного підготовленого серійного розведення. Отримані колонії підраховують і дають оцінку кількості клітин в початкових об'ємних зразках.

Наприклад, дуже розбавлений зразок - питна вода - може не містити достатньої кількості організмів для використання будь-якого з описаних методів підрахунку пластин. У таких випадках початковий зразок повинен бути концентрований, а не розведений перед нанесенням покриття. Це може бути досягнуто за допомогою модифікації техніки підрахунку пластин, яка називається технікою мембранної фільтрації. Відомі обсяги асептично фільтруються вакуумом через мембрану з розміром пор, досить малим для уловлювання мікроорганізмів. Мембрана переноситься на пластину Петрі, що містить відповідне середовище для росту. Колонії підраховують після інкубації. Розрахунок щільності клітин проводиться шляхом ділення кількості клітин на обсяг відфільтрованої рідини.

Посилання на навчання

Подивіться це відео для демонстрації серійних розведень і поширення пластинчастих технік.

Найбільш ймовірне число

Кількість мікроорганізмів у розведених зразках зазвичай занадто низька, щоб їх можна було виявити методами підрахунку пластин, описаними до цих пір. Для цих зразків мікробіологи зазвичай використовують метод найбільш ймовірного числа (MPN) - статистичну процедуру оцінки кількості життєздатних мікроорганізмів у вибірці. Часто використовуваний для зразків води та їжі, метод MPN оцінює виявлений ріст, спостерігаючи зміни каламутності або кольору через метаболічну активність.

Типовим застосуванням методу MPN є оцінка кількості коліформ у зразку водоймистової води. Коліформи - це грамнегативні паличкові бактерії, які ферментують лактозу. Наявність коліформ у воді вважається ознакою забруднення каловими масами. Для методу, проілюстрованого на малюнку\(\PageIndex{13}\), серію з трьох розведень зразка води перевіряють шляхом інокуляції п'яти пробок з відваром лактози 10 мл зразка, п'яти пробок для відвару лактози з 1 мл зразка та п'яти пробок для відвару лактози з 0,1 мл зразка. У пробірках з відваром лактози міститься показник рН, який змінює колір з червоного на жовтий при ферментації лактози. Після щеплення і інкубації пробірки досліджують на предмет показання зростання кишкової палички зміною кольору середовищ від червоного до жовтого. Перший набір пробирок (проба на 10 мл) показав зростання у всіх пробірках; другий набір пробирок (1 мл) показав зростання в двох пробірках з п'яти; в третьому наборі пробирок зростання не спостерігається ні в одній з пробирок (0,1-мл розведення). Числа 5, 2 і 0 порівнюються з малюнком В1 в додатку В, який був побудований з використанням імовірнісної моделі процедури вибірки. З нашого прочитання таблиці робимо висновок, що 49 - це найбільш ймовірна кількість бактерій на 100 мл ставкової води.

Малюнок\(\PageIndex{13}\): У найбільш ймовірному методі числення набори з п'яти пробірок з відвару лактози щеплять трьома різними обсягами водойми: 10 мл, 1 мл та 0,1 мл. Бактеріальний ріст оцінюється через зміну кольору відвару від червоного до жовтого в міру ферментації лактози.

Вправа\(\PageIndex{6}\)

1. Що таке колонієутворююча одиниця?
2. Які два методи часто використовуються для оцінки кількості бактерій у зразках води?

Непрямі підрахунки клітин

Крім прямих методів підрахунку клітин, для оцінки та порівняння щільності клітин в культурі зазвичай використовуються інші методи, засновані на непрямому виявленні щільності клітин. Першочерговим підходом є вимірювання помутніння (помутніння) зразка бактерій в рідкій суспензії. Лабораторний прилад, який використовується для вимірювання каламутності, називається спектрофотометром (рис.\(\PageIndex{14}\)). У спектрофотометрі світловий промінь передається через бактеріальну суспензію, світло, що проходить через суспензію, вимірюється детектором, а кількість світла, що проходить через зразок і досягає детектора, перетворюється або на відсоток пропускання, або в логарифмічне значення, яке називається поглинанням (Оптична щільність). Зі збільшенням кількості бактерій у суспензії каламутність також збільшується і змушує менше світла потрапляти на детектор. Зменшення світла, що проходить через зразок і досягає детектора, пов'язане зі зменшенням відсотка пропускання і збільшенням поглинання, виміряного спектрофотометром.

Вимірювання каламутності - це швидкий метод оцінки щільності клітин до тих пір, поки в зразку є достатньо клітин для отримання каламутності. Можна співвіднести показання каламутності з фактичною кількістю клітин, виконуючи життєздатну кількість пластин зразків, взятих з культур, що мають діапазон значень поглинання. Використовуючи ці значення, калібрувальна крива генерується шляхом побудови помутніння як функції щільності комірок. Після того, як калібрувальна крива була виготовлена, її можна використовувати для оцінки кількості клітин для всіх зразків, отриманих або культивованих в аналогічних умовах та з щільністю в межах діапазону значень, що використовуються для побудови кривої.

Малюнок\(\PageIndex{14}\): (а) Спектрофотометр зазвичай використовується для вимірювання помутніння суспензії бактеріальних клітин як непрямого показника щільності клітин. (б) Спектрофотометр працює шляхом розщеплення білого світла від джерела на спектр. Спектрофотометр дозволяє вибрати довжину хвилі світла для вимірювання. Оптична щільність (каламутність) зразка буде залежати від довжини хвилі, тому, як тільки буде обрана одна довжина хвилі, її потрібно використовувати послідовно. Відфільтроване світло проходить через зразок (або елемент керування лише середовищем), а інтенсивність світла вимірюється детектором. Світло, що переходить в суспензію бактерій, розсіюється клітинами таким чином, що якась його частка ніколи не доходить до детектора. Це розсіювання відбувається в набагато меншій мірі в контрольній трубці тільки з середовищем. (Кредит а: модифікація роботи Hwang HS, Kim MS; кредит b «фотографії пробірки»: модифікація роботи Сюзанни Вакім)

Вимірювання сухої маси культурального зразка є ще одним непрямим методом оцінки щільності культури без безпосереднього вимірювання кількості клітин. Клітинну суспензію, що використовується для зважування, перед проведенням вимірювань необхідно концентрувати шляхом фільтрації або центрифугування, промити, а потім висушити. Ступінь висихання повинна бути стандартизована для обліку залишкового вмісту води. Цей метод особливо корисний для ниткоподібних мікроорганізмів, які важко перерахувати за прямим або життєздатним підрахунком пластин.

Як ми бачили, методи оцінки життєздатних клітин можуть бути трудомісткими і займають час, оскільки клітини повинні бути вирощені. Останнім часом були розроблені непрямі способи вимірювання живих клітин, які є одночасно швидкими і легкими в реалізації. Ці методи вимірюють активність клітин, слідуючи за виробництвом продуктів метаболізму або зникненням реагентів. Утворення аденозинтрифосфату (АТФ), біосинтез білків та нуклеїнових кислот та споживання кисню можна контролювати для оцінки кількості клітин.

Вправа\(\PageIndex{7}\)

1. Яка мета калібрувальної кривої при оцінці кількості клітин за вимірюваннями каламутності?
2. Які нові непрямі методи підрахунку живих клітин?

Альтернативні закономірності поділу клітин

Бінарне ділення - найпоширеніша картина поділу клітин у прокаріотів, але вона не єдина. Інші механізми зазвичай передбачають асиметричне поділ (як при бутонізації) або вироблення спор у повітряних нитках.

У деяких ціанобактерій багато нуклеоїдів можуть накопичуватися в збільшеній круглої клітці або уздовж нитки, що призводить до утворення відразу багатьох нових клітин. Нові комірки часто відділяються від батьківської нитки і спливають у процесі, який називається фрагментацією (рис.\(\PageIndex{15}\)). Фрагментація зазвичай спостерігається у актиноміцетів, групи грампозитивних анаеробних бактерій, які зазвичай зустрічаються в грунті. Ще один цікавий приклад поділу клітин у прокаріотів, що нагадує живі народження у тварин, виставляє гігантська бактерія Epulopiscium. Кілька дочірніх клітин повністю ростуть в батьківській клітині, яка з часом розпадається, вивільняючи нові клітини в навколишнє середовище. Інші види можуть утворювати довге вузьке розширення на одному полюсі в процесі, який називається бутонізацією. Верхівка розширення розбухає і утворює меншу клітинку, бутон, яка з часом відривається від батьківської клітини. Бутонізація найчастіше зустрічається у дріжджів (рис.\(\PageIndex{15}\)), але також спостерігається у протезних бактерій і деяких ціанобактерій.

Малюнок\(\PageIndex{15}\): (а) Нитчасті ціанобактерії, як і зображені тут, тиражуються фрагментацією. (б) На цій електронній мікрофотографії клітини бактерії Gemmata obscuriglobus брунькуються. Більша клітина - материнська клітина. Мітки вказують на нуклеоїди (N) і ще утворюючу ядерну оболонку (NE) дочірньої клітини. (Кредит а: модифікація роботи CSIRO; кредит б: модифікація роботи Куо-Чанг Лі, Рік I Вебб та Джон А Фюрст)

Грунтові бактерії Actinomyces ростуть у довгих нитках, розділених перегородками, подібними до міцелії, що спостерігається у грибів, в результаті чого утворюються довгі клітини з множинними нуклеоїдами. Екологічні сигнали, ймовірно, пов'язані з низькою доступністю поживних речовин, призводять до утворення повітряних ниток. Усередині цих повітряних ниток одночасно діляться подовжені клітини. Нові клітини, в яких міститься єдиний нуклеоїд, розвиваються в спори, що дають початок новим колоніям.

Вправа\(\PageIndex{8}\)

Визначте хоча б одну різницю між фрагментацією та бутонізацією.

Біоплівки

У природі мікроорганізми ростуть переважно в біоплівках, складних і динамічних екосистемах, які утворюються на різних поверхнях навколишнього середовища, від промислових трубопроводів і водопровідних трубопроводів до гірських порід в руслах річок. Однак біоплівки не обмежуються твердими поверхневими підкладками. Майже будь-яка поверхня в рідкому середовищі, що містить деякі мінімальні поживні речовини, з часом розвине біоплівку. Наприклад, мікробні мати, які плавають на воді, - це біоплівки, які містять великі популяції фотосинтетичних мікроорганізмів. Біоплівки, знайдені в роті людини, можуть містити сотні видів бактерій. Незалежно від середовища, де вони відбуваються, біоплівки не є випадковими колекціями мікроорганізмів; скоріше, вони є високоструктурованими спільнотами, які забезпечують вибіркову перевагу своїм складовим мікроорганізмам.

Структура біоплівки

Спостереження за допомогою конфокальної мікроскопії показали, що умови навколишнього середовища впливають на загальну структуру біоплівок. Нитчасті біоплівки, звані стримерами, утворюються у швидко течій воді, такій як прісноводні потоки, вихрові та спеціально розроблені лабораторні проточні клітини, які відтворюють умови росту у швидкоплинних рідинях. Стримери закріплені на підкладці «головою», а «хвіст» плаває вниз за течією в течії. У нерухомій або тихохідній воді біоплівки в основному приймають грибоподібну форму. Структура біоплівок також може змінюватися з іншими умовами навколишнього середовища, такими як наявність поживних речовин.

Детальні спостереження біоплівок під конфокальними лазерними та скануючими електронними мікроскопами виявляють кластери мікроорганізмів, вбудованих в матрицю з вкрапленнями відкритих каналів води. Позаклітинний матрикс складається з позаклітинних полімерних речовин (ЕПС), що виділяються організмами в біоплівці. Позаклітинний матрикс являє собою велику частку біоплівки, на частку якої припадає 50% — 90% від загальної сухої маси. Властивості EPS змінюються залежно від резидентних організмів та умов навколишнього середовища.

EPS - це гідратований гель, що складається в основному з полісахаридів і містить інші макромолекули, такі як білки, нуклеїнові кислоти та ліпіди. Він відіграє ключову роль у підтримці цілісності та функції біоплівки. Канали в EPS дозволяють переміщати поживні речовини, відходи та гази по всій біоплівці. Це підтримує зволоження клітин, запобігаючи висушування. EPS також захищає організми в біоплівці від хижацтва іншими мікробами або клітинами (наприклад, найпростішими, лейкоцитами в організмі людини).

Формування біоплівки

Вільно плаваючі мікробні клітини, які живуть у водному середовищі, називаються планктонними клітинами. Формування біоплівки по суті передбачає приєднання планктонних клітин до субстрату, де вони стають сидячими (прикріплюються до поверхні). Це відбувається поетапно, як зображено на малюнку\(\PageIndex{16}\). Перший етап передбачає кріплення планктонних клітин до поверхні, покритої кондиціонуючої плівкою з органічного матеріалу. У цей момент кріплення до субстрату оборотне, але оскільки клітини експресують нові фенотипи, що полегшують утворення ЕПС, вони переходять від планктонного до сидячого способу життя. Біоплівка розвиває характерні структури, включаючи велику матрицю і водні канали. Такі придатки, як fimbriae, pili, і джгутики взаємодіють з ЕРС, а мікроскопія і генетичний аналіз дозволяють припустити, що такі структури потрібні для створення зрілої біоплівки. На останньому етапі життєвого циклу біоплівки клітини на периферії біоплівки повертаються до планктонічного способу життя, відриваючи зрілу біоплівку, щоб колонізувати нові ділянки. Цей етап називають розгоном.

Малюнок\(\PageIndex{16}\): Етапи формування і життєвого циклу біоплівки. (кредит: модифікація роботи Публічної бібліотеки науки та Американського товариства мікробіології)

У біоплівці різні види мікроорганізмів встановлюють метаболічну колаборацію, при якій продукт життєдіяльності одного організму стає поживною речовиною для іншого. Наприклад, аеробні мікроорганізми споживають кисень, створюючи анаеробні області, що сприяють зростанню анаеробів. Це відбувається при багатьох полімікробних інфекціях, які включають як аеробні, так і анаеробні збудники.

Механізм, за допомогою якого клітини в біоплівці координують свою діяльність у відповідь на подразники навколишнього середовища, називається зондуванням кворуму. Сенсування кворуму - яке може відбуватися між клітинами різних видів у біоплівці - дозволяє мікроорганізмам виявляти свою щільність клітин шляхом вивільнення та зв'язування малих дифузійних молекул, які називаються аутоіндукторами. Коли популяція клітин досягає критичного порогу (кворуму), ці аутоіндуктори ініціюють каскад реакцій, які активують гени, пов'язані з клітинними функціями, які корисні лише тоді, коли популяція досягає критичної щільності. Наприклад, у деяких збудників синтез факторів вірулентності починається лише тоді, коли присутня достатня кількість клітин, щоб перевантажити імунний захист господаря. Хоча в основному вивчається в бактеріальних популяціях, зондування кворуму відбувається між бактеріями та еукаріотами та між еукаріотичними клітинами, такими як грибок Candida albicans, загальний член людської мікробіоти, який може спричинити інфекції у людей з ослабленим імунітетом.

Сигнальні молекули в зондуванні кворуму належать до двох основних класів. Грамнегативні бактерії спілкуються в основному за допомогою N-ацильованих гомозерінових лактонів, тоді як грампозитивні бактерії в основному використовують невеликі пептиди (рис.\(\PageIndex{17}\)). У всіх випадках перший крок зондування кворуму полягає в зв'язуванні аутоіндуктора з його специфічним рецептором тільки при досягненні порогової концентрації сигнальних молекул. Як тільки відбувається зв'язування з рецептором, каскад сигнальних подій призводить до змін експресії генів. Результатом є активація біологічних реакцій, пов'язаних із зондуванням кворуму, зокрема збільшення виробництва самих сигнальних молекул, звідси і термін автоіндуктор.

Малюнок\(\PageIndex{17}\): Короткі пептиди в грампозитивних бактеріях та N-ацетильовані гомозерінові лактони у грамнегативних бактеріях діють як аутоіндуктори при зондуванні кворуму та опосередковують скоординовану відповідь бактеріальних клітин. Бічний ланцюг R N-ацетильованого гомозерінового лактону специфічна для видів грамнегативних бактерій. Деякі секретовані гомозерінові лактони розпізнаються більш ніж одним видом.

Біоплівки і здоров'я людини

Людський організм таїть в собі безліч видів біоплівок, деякі корисні і деякі шкідливі. Наприклад, шари нормальної мікробіоти, що вистилають слизову оболонку кишечника та дихальних шляхів, відіграють певну роль у запобіганні інфекцій хвороботворними мікроорганізмами. Однак інші біоплівки в організмі можуть згубно позначитися на здоров'ї. Наприклад, наліт, який утворюється на зубах, - це біоплівка, яка може сприяти захворюванням зубів і пародонту. Біоплівки також можуть утворюватися в ранах, іноді спричиняючи серйозні інфекції, які можуть поширюватися. Бактерія Pseudomonas aeruginosa часто колонізує біоплівки в дихальних шляхах хворих на муковісцидоз, викликаючи хронічні, а іноді і смертельні інфекції легенів. Біоплівки також можуть утворюватися на медичних пристроях, що використовуються в організмі або на тілі, викликаючи інфекції у пацієнтів з внутрішніми катетерами, штучними суглобами або контактними лінзами.

Патогени, вбудовані в біоплівки, виявляють більш високу стійкість до антибіотиків, ніж їх вільно плаваючі аналоги. Було запропоновано кілька гіпотез, щоб пояснити, чому. Клітини в глибоких шарах біоплівки метаболічно неактивні і можуть бути менш сприйнятливі до дії антибіотиків, що порушують метаболічну діяльність. ЕПС також може уповільнити дифузію антибіотиків і антисептиків, запобігаючи їх досягненню клітин в глибоких шарах біоплівки. Фенотипові зміни можуть також сприяти підвищенню стійкості, що проявляється бактеріальними клітинами в біоплівках. Наприклад, збільшене виробництво потокових насосів, вбудованих в мембрану білків, які активно видавлюють антибіотики з бактеріальних клітин, було показано, що є важливим механізмом стійкості до антибіотиків серед бактерій, пов'язаних з біоплівкою. Нарешті, біоплівки забезпечують ідеальне середовище для обміну екстрахромосомної ДНК, яка часто включає гени, що надають резистентність до антибіотиків.

Вправа\(\PageIndex{9}\)

1. З чого складається матриця біоплівки?
2. Яка роль зондування кворуму в біоплівці?

Ключові поняття та резюме

• Більшість бактеріальних клітин ділиться шляхом бінарного поділу. Час генерації в бактеріальному зростанні визначається як час подвоєння популяції.
• Клітини замкнутої системи слідують за схемою зростання з чотирма фазами: відставанням, логарифмічною (експоненціальною), стаціонарною та смертю.
• Клітини можна підрахувати за прямим підрахунком життєздатних клітин. Пластинчасті та розливні пластини методи використовуються для пластинчастих серійних розведень на або на агар, відповідно, щоб дозволити підрахунок життєздатних клітин, які породжують колонієутворюючі одиниці. Мембранна фільтрація використовується для підрахунку живих клітин в розведених розчинами. Метод найбільш ймовірного числа клітин (MPN) дозволяє оцінювати кількість клітин у культурах без використання твердих середовищ.
• Непрямі методи можуть бути використані для оцінки щільності культури шляхом вимірювання помутніння культури або щільності живих клітин шляхом вимірювання метаболічної активності.
• Інші закономірності поділу клітин включають багаторазове утворення нуклеоїдів у клітині; асиметричний поділ, як при бутонізації; і утворення гіф і кінцевих спор.
• Біоплівки - це спільноти мікроорганізмів, що входять в матрикс позаклітинної полімерної речовини. Освіта біоплівки відбувається, коли планктонні клітини прикріплюються до субстрату і стають сидячими. Клітини в біоплівках координують свою діяльність, спілкуючись через зондування кворуму.
• Біоплівки зазвичай зустрічаються на поверхнях в природі та в організмі людини, де вони можуть бути корисними або викликати важкі інфекції. Збудники, пов'язані з біоплівками, часто більш стійкі до антибіотиків і дезінфікуючих засобів.