2: Мікроскопи

Ви, напевно, зрозуміли, що мікроби (мікроорганізми AKA) досить малі, правда? Так, ну, розмір - це ще не все. Але цифри, це щось. Якби ви взяли один грам ґрунту і почали підраховувати мікроби в ньому зі швидкістю 1 мікроб/секунду, вам знадобиться більше 33 років, щоб завершити підрахунок. Тоді більшість з вас були б у 50-х роках і мали кризу середнього віку, тому давайте не йдемо туди... але невеликий розмір мікробів, безумовно, ускладнив їх вивчення, особливо на початку. (Якщо ви хочете отримати візуальне уявлення про масштаб, скористайтеся інструментом «Розмір комірки та масштаб», який дозволяє збільшити масштаб від кавового зерна до атома вуглецю. Обов'язково зверніть пильну увагу на мікроби між ними!)

Добре, якщо ви хочете побачити щось дуже, дійсно, дуже маленьке, кому ви збираєтеся зателефонувати? Не ^TM Мисливці за привидами, це точно. Я б спробував когось з мікроскопом. (Мікроскоп Людина? Можливо, ні.) Тепер я визнаю, що з появою молекулярної біології сьогодні існує багато мікробіології, яка відбувається без мікроскопа. Але якщо ви хочете візуалізувати мікроби, вам знадобиться здатність збільшувати - вам знадобиться мікроскоп якогось типу. І оскільки «бачити - це вірити», саме візуалізація мікробів змусила людей зацікавитись ними в першу чергу.

Мікроскопія в 1600-х роках

Вважається, що Роберт Гук був одним з перших вчених, які насправді спостерігали мікроби, в 1665 році. Його ілюстрації та спостереження з різних об'єктів, переглянутих під мікроскопом, були опубліковані в книзі Micrographia. Гук використовував складний мікроскоп, тобто він містив два набори лінз для збільшення: очна лінза поруч з оком і об'єктив, поруч із зразком або об'єктивним об'єктивом. Збільшення складного мікроскопа є продуктом збільшення очної лінзи і збільшення об'єктива об'єктива. Таким чином, мікроскоп із збільшенням очей у 10 разів та об'єктивним збільшенням 50 разів мав би загальне збільшення 500x. Ви можете побачити креслення мікроскопа Гука.

Антоні ван Леувенгук, якого часто називають «Батьком мікробіології», не був вченим за професією. Він був торговцем тканинами з Голландії, який, як вважалося, натхненний роботою містера Гука, ймовірно, з оригінальним наміром вивчити текстиль для визначення якості. Дуже швидко ван Леувенгук почав вивчати майже все під мікроскопом, і ми це знаємо, тому що він зберігав докладні нотатки як про свої зразки, так і про свої спостереження. Ван Леувенгук використовував те, що називається простим мікроскопом, мікроскопом лише з однією лінзою. По суті, це збільшувальне скло. Але лінзи, які він випускав, були настільки високої якості, що йому віддають заслугу за відкриття одноклітинних форм життя. Ви можете дізнатися більше про спостереження ван Леувенгука.

Сучасна мікроскопія: світлові мікроскопи

Подивимося правді в очі, сучасний мікроскоп - це досить технічний інструмент, навіть одна з більш дешевих версій. Якщо ви хочете зрозуміти обмеження світлового мікроскопа, ви повинні зрозуміти такі поняття, як роздільна здатність, довжина хвилі та числова апертура, де їх зв'язок один з одним підсумовується рівнянням Аббе:

У мікроскопії визначення роздільної здатності, як правило, є здатність лінзи розрізняти два об'єкти, які знаходяться близько один до одного. Отже, у рівнянні Аббе d стає мінімальною відстанню, де два об'єкти поруч один з одним можуть бути вирішені або розрізнені як окремі об'єкти. Роздільна здатність залежить від довжини хвилі освітлення, яка використовується, де коротша довжина хвилі призведе до меншої d. Нарешті, ми маємо ефект числової діафрагми, яка є функцією об'єктивної лінзи та її здатності збирати світло. Числове значення діафрагми насправді визначається двома компонентами: n, який є показником заломлення середовища, в якому працює лінза, і sin θ, що є вимірюванням конуса світла, який потрапляє в ціль. Лінза зазвичай може працювати в двох середовищах: повітряному, з показником заломлення 1,00, або в маслі, з показником заломлення 1,25. Масло дозволить зібрати більше світла, направляючи більше світлових променів в об'єктив. Максимальне загальне збільшення для мікроскопа, що використовує візуальне світло для освітлення, становить близько 1500X, де мікроскоп може мати 15-кратний окулярів і 100-кратний об'єкт занурення масла. Найвища можлива роздільна здатність - близько 0,2 мкм. Якщо об'єкти або клітинки знаходяться ближче один до одного, їх не можна виділити як окремі сутності.

Ось приємний опис від Nikon, включаючи інтерактивний підручник з числової діафрагми та роздільної здатності зображення. А тут стільки мікроскопів, так мало часу! Тип, який вам потрібен, залежить від конкретного типу мікробів, які ви хочете візуалізувати.

Для світлових мікроскопів існує шість різних типів мікроскопів, всі використовують світло як джерело освітлення: мікроскоп яскравого поля, мікроскоп темного поля, мікроскоп фазового контрасту, диференціальний інтерференційний контраст (DIC), флуоресцентний мікроскоп та конфокальний скануючий лазерний мікроскоп (CSLM). Давайте розглянемо деталі кожного типу:

Яскраве поле мікроскоп

Мікроскоп яскравого поля - це ваш стандартний мікроскоп, який ви можете придбати для племінниці або племінника в будь-якому магазині іграшок. Ось веб-сайт про основні частини яскравого поля складного мікроскопа, якщо ви не зараховані в загальну мікробіологічну лабораторію. Зразок освітлюється джерелом світла біля основи мікроскопа, а потім спочатку збільшується об'єктивом, перш ніж знову збільшуватися очною лінзою. Пам'ятайте, що досягнуте повне збільшення є продуктом збільшення обох лінз.

Зразок зазвичай візуалізується через відмінності в контрасті між самим зразком та навколишнім середовищем. Але це не стосується незаплямованих бактерій, які мають дуже мало контрасту з навколишнім середовищем, якщо клітини природно не пігментовані. Саме тому фарбування (див. Розділ нижче) - таке важливе поняття в мікроскопії. Мікроскоп з яскравим полем буде працювати досить добре для перегляду більших еукаріотичних мікробів (тобто найпростіших, водоростей) без плям, але незабарвлені бактерії будуть майже невидимі. Забруднені бактерії будуть здаватися темними на яскравому тлі (ах, я знала, що є причина терміна «світле поле».)

Яскраве поле мікроскоп

Мікроскоп темного поля

Мікроскоп темного поля насправді просто трохи модифікований мікроскоп яскравого поля. Насправді, ви можете зробити цю модифікацію мікроскопом, який у вас є вдома! Він використовує те, що відомо як зупинка темного поля, непрозорий диск, який блокує світло безпосередньо під зразком, так що світло досягає його з боків. Результатом є те, що лінзою об'єктиву буде зібрано лише світло, яке відбилося або заломлено зразком, в результаті чого клітини здаються яскравими на темному тлі (таким чином термін «темне поле». Так, це все має сенс зараз). Це дозволяє спостерігати за живими, незаплямованими клітинами, що особливо приємно, якщо ви хочете спостерігати моторику або еукаріотичні органели.

Фазовий контрастний мікроскоп

Фазоконтрастний мікроскоп також є модифікованим мікроскопом яскравого поля, хоча модифікації стають все більш складними, а також дорожчими. Цей мікроскоп також використовує непрозоре кільце або кільцевий упор, але цей має прозоре кільце, яке випускає світло лише в порожнистому конусі. Принцип роботи цього мікроскопа повертається до ідеї показника заломлення і того факту, що клітини мають інший показник заломлення, ніж їх оточення, в результаті чого світло трохи відрізняється по фазі. Різниця посилюється фазним кільцем, знайденим у спеціальному фазовому об'єкті. Фазові відмінності можуть бути перетворені на відмінності в яскравості, в результаті чого темне зображення серед яскравого фону. Це дозволяє спостерігати за живими, незаплямованими клітинами, в черговий раз корисно спостерігати моторику або еукаріотичні органели.

Механіка мікроскопа фазового контрасту.

Мікроскоп диференціальної інтерференції (DIC)

Диференціальний інтерференційний контрастний мікроскоп працює за тим же принципом, що і мікроскоп фазового контрасту, використовуючи переваги відмінностей у показнику заломлення зразка та його оточення. Але він використовує поляризоване світло, яке потім розділяється на два промені призмою. Один промінь світла проходить крізь екземпляр, інший проходить через навколишню територію. Коли балки об'єднуються за допомогою другої призми, вони «заважають» один одному, через вихід з фази. Отримані зображення мають майже 3D ефект, корисний для спостереження за живими, незаплямованими клітинами.

Диференціальний контрастний механізм мікроскопа.

Флуоресцентний мікроскоп

Флуоресцентний мікроскоп використовує світло, яке випромінювалося від зразка, а не проходить через нього. Ртутно-дугова лампа використовується для генерації інтенсивного променя світла, який фільтрується для отримання певної довжини хвилі світла, спрямованого на зразок, за допомогою дихроматичного дзеркала, яке відображає короткі довжини хвиль і передає більші довжини хвиль. Природно флуоресцентні організми поглинають короткохвильові довжини і випромінюють флуоресцентне світло з більшою довжиною хвилі, яке пройде через дихроматичне дзеркало і може бути візуалізовано. Існує безліч мікробів з природною флуоресценцією, але, безумовно, набагато більше організмів, яким не вистачає цієї якості. Візуалізація останніх організмів залежить від використання флюорохромів, флуоресцентних барвників, які зв'язуються з конкретними компонентами клітин. Флюорохроми також можуть бути прикріплені до антитіл, щоб виділити конкретні структури або ділянки клітини, або навіть різні організми.

Флуоресцентний мікроскоп. Мазур (Власна робота) [GFDL, CC-BY-SA-3.0 або CC BY-SA 2.5-2.0-1.0], через Вікісховище

Механізм флуоресцентного мікроскопа.

Конфокальний скануючий лазерний мікроскоп (CSLM)

Для того, щоб зрозуміти, як працює конфокальний скануючий лазерний мікроскоп, корисно зрозуміти, як працює флуоресцентний мікроскоп, тому, сподіваємось, ви вже прочитали попередній розділ. CSLM використовує лазер для освітлення, завдяки високій інтенсивності. Світло спрямоване на двохроматичні дзеркала, які рухаються, «скануючи» зразок. Довші довжини хвиль, випромінювані флуоресцентно забарвленим зразком, проходять назад через дзеркала, через точкове отвір, і вимірюються детектором. Точка служить для con jugate фокусної точки об'єктива (ах, ось звідки походить термін конфокальний!) , що означає, що це дозволяє повністю фокусувати задану точку. Оскільки весь зразок сканується в площині x-z (всі три осі), інформація, отримана детектором, може бути скомпільована комп'ютером для створення єдиного 3D-зображення повністю у фокусі. Це особливо корисний інструмент для перегляду складних структур, таких як біоплівки.

Механізм конфокального сканування лазерного мікроскопа.

Фарбування

Більшість мікробів, особливо одноклітинних мікробів, не були б помітні без допомоги фарбування. Це допомагає зробити щось таке маленьке трохи легше бачити, забезпечуючи контраст між мікроорганізмом і його фоном. Проста пляма використовує один барвник, або для фарбування клітин безпосередньо (пряма пляма), або для фарбування фону, що оточує клітини (негативна пляма). З цього дослідник може зібрати основну інформацію про розмір клітини, морфологію (форму) та розташування клітин.

Існують також більш складні плями, відомі як диференціальні плями, які поєднують плями, щоб забезпечити диференціацію організмів на основі їх характеристик. Забарвлення Грама, розроблена в 1884 році, є найпоширенішим диференціальним плямою, що використовується в мікробіології, де бактеріальні клітини відокремлюються залежно від типу їх клітинної стінки: грампозитивні бактерії, які забарвлюють фіолетовий колір та грамнегативні бактерії, які забарвлюють рожевий колір. Деякі бактерії мають спеціалізовану клітинну стінку, яку необхідно пофарбувати кислотостійкою плямою, де кислотостійкі бактерії забарвлюють червоний колір, а некислотостійкі бактерії забарвлюють синій колір. Інші диференціальні плями націлені на конкретні бактеріальні структури, такі як ендоспори, капсули та джгутики, про які слід говорити пізніше.

Ще більш сучасна мікроскопія: електронні мікроскопи

Світлові мікроскопи чудово підходять, якщо ви спостерігаєте еукаріотичні мікроби, і вони можуть працювати для спостереження за бактеріями та архей, але вони взагалі не збираються працювати для спостереження за вірусами. Пам'ятайте, що межа дозволу для світлового мікроскопа становить 0,2 мкм або 200 нм і більшість вірусів менше цього. Отже, нам потрібно щось більш потужне. Введіть електронні мікроскопи, які замінюють світло електронами для візуалізації. Оскільки електрони мають довжину хвилі 1,23 нм (на відміну від довжини хвилі 530 нм синьо-зеленого світла), роздільна здатність збільшується приблизно до 0,5 нм, зі збільшенням понад 150 000 разів. Недоліком використання електронів є те, що вони повинні міститися у вакуумі, виключаючи можливість роботи з живими клітинами. Існує також певна стурбованість тим, що велика підготовка зразків може спотворити характеристики зразка або спричинити утворення артефактів.

Існує два різних типи електронного мікроскопа, просвічувальний електронний мікроскоп (TEM) та скануючий електронний мікроскоп (SEM):

Трансмісійний електронний мікроскоп (ТЕМ)

Просвічувальний електронний мікроскоп використовує електронний промінь, спрямований на зразок з використанням електромагнітів. Щільні ділянки розсіюють електрони, в результаті чого на зображенні утворюється темна область, в той час як електрони можуть проходити (або «передавати») через менш щільні ділянки, в результаті чого відбувається більш яскравий перетин. Зображення генерується на флуоресцентному екрані, а потім може бути захоплено.

Оскільки електрони легко розсіюються надзвичайно товстими зразками, зразки повинні бути нарізані товщиною до 20-100 нм, як правило, шляхом вбудовування в якийсь тип пластику, а потім нарізані алмазним ножем на надзвичайно тонкі ділянки. Отримані картинки представляють один зріз або площину екземпляра.

Промісійний електронний мікроскоп.

Промісійний електронний мікроскоп. Kallerna (Власна робота) [Громадське надбання], через Wikimedia Commons

Скануючий електронний мікроскоп (SEM)

Скануючий електронний мікроскоп також використовує електронний промінь, але зображення формується з вторинних електронів, які були випущені з поверхні зразка, а потім зібрані детектором. З піднятих ділянок зразка виділяється більше електронів, тоді як з затонулих ділянок буде збиратися менше вторинних електронів. Крім того, електронний промінь сканується над поверхнею зразка, створюючи 3D-зображення зовнішніх ознак.

Якщо ви хочете побачити деякі красиві TEM і SEM фотографії, перевірте сайт Денніса Кункеля. Більшість були розфарбовані, але вони досить приголомшливі. На іншому кінці спектра тут представлені знімки, зроблені за допомогою Intel Play QX3, пластикового мікроскопа для дітей. Будьте обережні, ви можете загубитися на цьому веб-сайті. Але це здорово бачити, що недорогий мікроскоп може виробляти в руках того, хто знає, що вони роблять! Ці фотографії приголомшливі, а також.

Механізм сканування електронного мікроскопа.

Скануючий електронний мікроскоп. За en:User:Olaboy [CC BY-SA 2.5], через Вікісховище Вікіпедії

Мікроскопія 21-го століття: скануючі зондові мікроскопи

Оскільки технологія просунулася, були винайдені ще більш потужні мікроскопи, ті, які можуть навіть дозволити візуалізацію на атомному рівні. Ці мікроскопи можуть бути використані в мікробіології, але частіше вони використовуються в інших областях, щоб дозволити візуалізацію хімічних речовин, металів, магнітних зразків і наночастинок, де може знадобитися роздільна здатність 0,1 нм і 100,000,000x збільшення.

Скануючі зондові мікроскопи, таким чином, названі тому, що вони переміщують певний тип зонда над поверхнею зразка в площині x-z, що дозволяє комп'ютерам генерувати надзвичайно детальне 3D-зображення зразка. Роздільна здатність настільки висока, оскільки розмір зонда набагато менший, ніж довжина хвилі видимого світла або електронів. Обидва мікроскопа можуть використовуватися для дослідження об'єктів в рідині, що дозволяє досліджувати біологічні молекули. Існує два різних типи скануючих зондових мікроскопів: скануючий тунельний мікроскоп (STM) та атомно-силовий мікроскоп (AFM):

Скануючий тунельний мікроскоп (STM)

Скануючий тунельний мікроскоп має надзвичайно гострий зонд товщиною 1 атом, який підтримує постійну напругу з поверхнею зразка, що дозволяє електронам переміщатися між ними. Цей тунельний струм підтримується шляхом підняття та опускання зонда для підтримки постійної висоти над зразком. Отриманий рух відстежується комп'ютером, який генерує кінцеве зображення.

Механізм сканування тунельного мікроскопа.

Мікроскоп атомної сили (AFM)

Атомно-силовий мікроскоп був розроблений як альтернатива СТМ, для використання зі зразками, які погано проводять електрику. Мікроскоп використовує консоль з надзвичайно гострим наконечником зонда, який підтримує постійну висоту над зразком, як правило, шляхом прямого контакту зі зразком. Рух консолі для підтримки цього контакту відхиляє лазерний промінь, перетворюючись на зображення об'єкта. Знову ж таки, комп'ютери використовуються для генерації зображення.

Механізм мікроскопа атомної сили.

Ключові слова

збільшення, Роберт Гук, складний мікроскоп, окулярна лінза, об'єктив, повне збільшення, Ван Леувенгук, простий мікроскоп, рівняння Аббе, роздільна здатність, довжина хвилі, числова апертура, показник заломлення, об'єкт занурення масла, світловий мікроскоп, мікроскоп яскравого поля, мікроскоп темного поля, фаза контрастний мікроскоп, диференціальний інтерференційний контраст (DIC) мікроскоп, флуоресцентний мікроскоп, флюорохром, конфокальний скануючий лазерний мікроскоп (CSLM), просте пляма, пряме пляма, негативне пляма, диференціальна пляма, кислотостійка пляма, електронний мікроскоп (ЕМ), передавальний електронний мікроскоп (TEM), скануючий електронний мікроскоп (СЕМ), скануючі зондові мікроскопи, скануючі тунельні мікроскопи (СТМ), атомно-силовий мікроскоп (АСМ).

Основні питання/цілі

1. Які ролі зіграли Гук і ван Леувенгук в розробці мікроскопії? Чим відрізнялися їхні внески?
2. Чим відрізняються збільшення та роздільна здатність? Як визначається сумарне збільшення?
3. Як рівняння Аббе пояснює роздільну здатність мікроскопа? Які компоненти впливають на роздільну здатність? Яка функція занурення масла?
4. Знати основні сфери застосування та зрозуміти принципову механіку наступних світлових мікроскопів: яскраве поле, темне поле, фазовий контраст, флуоресценція та диференціальний інтерференційний контраст.
5. Як працює конфокальний скануючий лазерний мікроскоп для формування 3-мірного зображення? Як це покращує роздільну здатність порівняно з іншими світловими мікроскопами?
6. Як застосовується фарбування при мікроскопії? Які загальні категорії плям і як вони використовуються?
7. Які переваги та проблеми з електронними мікроскопами? Які ефективні збільшення, роздільна здатність і основні види використання електронних мікроскопів?
8. Чим ТЕМ відрізняється від СЕМ за функцією та кінцевим продуктом?
9. Як працюють скануючі зондові мікроскопи і що вони дозволяють нам бачити? Чому вони корисні для вивчення біологічних молекул? У чому відмінність скануючого тунелювання і атомно-силового мікроскопа?

Дослідницькі питання (НЕОБОВ'ЯЗКОВО)

1. Як мікроскопи покращили наше розуміння мікробів? Які обмеження мають мікроскопи та інформація, яку ми отримуємо від них?