13: Надмірна експресія білка

Last updated
Save as PDF

Page ID: 4805

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

У цій лабораторії ви будете використовувати різні джерела вуглецю для маніпулювання експресією злитих білків Met і LacZ в
клітині, які були перетворені плазмідами надмірної експресії. Фактор транскрипції Gal4p (вище) зв'язується з
промотором GAL1 в плазмідах і контролює експресію білка. У цій лабораторії ви підготуєте білкові
екстракти з клітин, що ростуть як в репресованих, так і в індукованих умовах для подальшого аналізу.

Цілі

Наприкінці цієї лабораторії студенти зможуть

Порівняйте вплив різних джерел вуглецю на транскрипцію генів, контрольованих промотором дріжджів GAL1.
Поясніть роль тепла і миючих засобів в приготуванні дріжджових клітинних екстрактів.
Культура дріжджів з різними джерелами вуглецю для індукування або придушення експресії з промотора GAL1.
Готують екстракти з перетворених штамів дріжджів, придатних для використання в гелі SDS-PAGE і західних плямах.

Протягом наступних кількох тижнів ви будете аналізувати експресію S. pombe та S. cerevisiae Met або бактеріальних злитих білків LaCZ у ваших трансформованих штамах. Ви вже перевірили здатність плазмід надмірної експресії доповнювати зустріну мутацію у ваших штамах дріжджів. Комплементація залежить від наявності функціональних протеїнів Мет. Якщо ви спостерігали нездатність доповнити дефіцит мет, це може свідчити про те, що білки не були експресовані з плазмід. Як варіант, надмірно виражені білки можуть бути присутніми, але не функціонувати нормально. Пам'ятайте, що білки, експресовані з плазмід BG1805 і PyES2.1, є злитими білками з додатковими послідовностями на їх C-termini (Gelperin et al. , 2005). Біохімічна активність цих злитих білків раніше не оцінювалася. (Ми першими перевіряємо, чи функціонують синтезовані білки Met подібно до нормальних білків S. cerevisiae!)

У цьому експерименті ви приготуєте екстракти з дріжджів для подальших експериментів (глави 14 і 15), в яких ви визначите, чи успішно експресуються білки злиття Met і LacZ в перетворених штамах дріжджів і як експресія злитих білків змінюється з джерелами вуглецю.