12: Перетворення дріжджів

Last updated
Save as PDF

Page ID: 4756

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Методи перетворення мікробних організмів з чужорідною ДНК мають важливе значення в сучасній молекулярній біології. У цій лабораторії
ви перетворите штам S. cerevisiae з трьома різними плазмідами та використаєте комплементацію ura3 для виявлення
перетворених клітин. Потім ви будете використовувати покриття репліки, щоб визначити, чи є гени S. pombe Met функціонально еквівалентні генам S. cerevisiae MET.

Цілі

Наприкінці цієї лабораторії студенти повинні мати можливість:

пояснити процеси трансформації і комплементації на молекулярному рівні.
розробити стратегію відбору для виділення перетворених штамів
перетворити S. cerevisiae з плазмідами та ізолювати трансформанти на селективних середовищах
використовувати покриття репліки для аналізу здатності генів MET, кодованих плазмою, доповнювати виявлені недоліки

У цьому експерименті ви можете отримати попередню відповідь на дослідницьке питання семестру про функціональне збереження білків Met в Ascomycota. Протягом першої частини семестру ваша команда використовувала селективне покриття та колонійну ПЛР для виявлення мутантів видалення дріжджів. Потім ви виділили та охарактеризували плазміди, які можна використовувати для надмірної експресії білків Met. Ці два набори експериментів збираються разом у цій лабораторії, коли ви перетворюєте деляційний штам S. cerevisiae з експресійними плазмідами. За допомогою серії експериментів з комплементації ви визначите, чи здатні гени, що переносяться на плазмідах, компенсувати відсутні гени MET у мутантів. При комплементації введений ген відновлює нормальний фенотип мутанту з дефектним геном.