Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

17.5B: Основні методи в аналізі білка

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    4741

    • Boundless
    • Boundless
    \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

    Цілі навчання
    • Опишіть методи, що використовуються в протеоміці для аналізу білків

    Основні методи в аналізі білка

    Кінцевою метою протеоміки є виявлення або порівняння білків, експресованих у даному геномі за певних умов, вивчення взаємодії між білками та використання інформації для прогнозування поведінки клітин або розробки лікарських цілей. Подібно до того, як геном аналізується за допомогою основної методики секвенування ДНК, протеоміка вимагає методів аналізу білка. Основною методикою аналізу білка, аналогом секвенування ДНК, є мас-спектрометрія.

    зображення
    Мас.\(\PageIndex{1}\): Мас-спектрометр: Матрична лазерна десорбція іонізації - час польоту (MALDI-TOF) мас-спектрометр. Мас-спектрометрія може бути використана в аналізі білка.

    Мас-спектрометрія

    Мас-спектрометрія використовується для ідентифікації та визначення характеристик молекули. Це техніка, в якій молекули газової фази іонізуються, а їх співвідношення маси до заряду вимірюється шляхом спостереження різниць прискорення іонів при застосуванні електричного поля. Більш легкі іони прискорюватимуться швидше і виявляться першими. Якщо маса вимірюється з точністю, то склад молекули можна ідентифікувати. У випадку з білками послідовність може бути ідентифікована. Проблемою методів, що використовуються для протеомних аналізів, є труднощі у виявленні невеликих кількостей білків, але досягнення в спектрометрії дозволили дослідникам аналізувати дуже малі зразки білка. Варіації експресії білка при хворих станах, однак, важко розрізнити. Білки є природно-нестабільними молекулами, що робить протеомний аналіз набагато складніше геномного аналізу.

    Рентгенівська кристалографія та ядерний магнітний резонанс

    Рентгенівська кристалографія дозволяє вченим визначати тривимірну структуру кристала білка при атомній роздільній здатності. Кристалографи націлюють потужні рентгенівські промені на крихітний кристал, що містить трильйони однакових молекул. Кристал розсіює рентгенівські промені на електронний детектор, який є тим же типом, який використовується для зйомки зображень у цифровій камері. Після кожного вибуху рентгенівських променів, що триває від декількох секунд до декількох годин, дослідники точно обертають кристал, вводячи його потрібну орієнтацію в комп'ютер, який керує рентгенівським апаратом. Це дозволяє вченим фіксувати в трьох вимірах, як кристал розсіює або дифрактує рентгенівські промені. Інтенсивність кожного дифракційного променя подається в комп'ютер, який використовує математичне рівняння для обчислення положення кожного атома в кристалізованій молекулі. В результаті виходить тривимірне цифрове зображення молекули.

    зображення
    Малюнок\(\PageIndex{1}\): Рентгенівська кристалографія: рентгенівські промені, що потрапляють на атомні ядра, дифрагуються на детекторі.

    Інша техніка візуалізації білка, ядерний магнітний резонанс (ЯМР), використовує магнітні властивості атомів для визначення тривимірної структури білків. ЯМР-спектроскопія унікальна тим, що здатна виявити атомну структуру макромолекул у розчині за умови, що можна отримати висококонцентрований розчин. Ця методика залежить від того, що певні атомні ядра є іскромагнітними. Хімічний зсув ядер залежить від їх місцевого середовища. Спини сусідніх ядер взаємодіють один з одним способами, що забезпечують остаточну структурну інформацію, яку можна використовувати для визначення повних тривимірних структур білків.

    Білкові мікромасиви та дво- гібридний скринінг

    Білкові мікромасиви також використовувалися для вивчення взаємодій між білками. Це масштабні адаптації базового двогібридного екрану. Передумова, що стоїть за двогібридним екраном, полягає в тому, що більшість еукаріотичних факторів транскрипції мають модульні активуючі та зв'язуючі домени, які все ще можуть активувати транскрипцію навіть при розділенні на два окремі фрагменти, якщо фрагменти принесені в безпосередній близькості один до одного. Як правило, фактор транскрипції ділиться на домен, що зв'язує ДНК (BD) та домен активації (AD). Один білок, що представляє інтерес, генетично зливається з БД, а інший білок зливається з АТ. Якщо два цікавлять білки зв'язують один одного, то BD і AD також зійдуться разом і активують репортерський ген, який сигналізує про взаємодію двох гібридних білків.

    зображення
    Малюнок\(\PageIndex{1}\): Двогібридний скринінг: Двогібридний скринінг використовується для визначення того, чи взаємодіють два білки. У цьому методі фактор транскрипції розбивається на домен, що зв'язує ДНК (BD) і домен активації (AD). Прив'язка домену здатна прив'язати промоутера при відсутності домену-активатора, але при цьому не включається транскрипція. Білок, званий приманкою, прикріплюється до БД, а білок, званий здобиччю, прикріплюється до АТ. Транскрипція відбувається тільки в тому випадку, якщо видобуток «ловить» приманку.

    Вестерн Блот

    Західний блот, або протеїновий імуноблот, - це техніка, яка поєднує в собі електрофорез білка та антитіла для виявлення білків у зразку. Західний пляма є досить швидким і простим порівняно з вищезазначеними техніками і, таким чином, може служити аналізом для перевірки результатів інших експериментів. Зразок білка спочатку відокремлюють гелевим електрофорезом, потім переносять на нітроцелюлозу або інший тип мембрани і, нарешті, забарвлюють первинним антитілом, який спеціально зв'язує цікавить білок. Флуоресцентне або радіоактивне мічене вторинне антитіло зв'язується з первинним антитілом і забезпечує засіб виявлення за допомогою фотографії або рентгенівської плівки відповідно.

    Ключові моменти

    • Мас-спектрометрія - це методика, яка корисна для визначення розміру білка або білкового комплексу.
    • Рентгенівська кристалографія і ЯМР - методи, корисні для визначення 3-D структури білкового або білкового комплексу.
    • Білкові мікромасиви корисні для визначення білково-білкових взаємодій.

    Ключові умови

    • мікромасив: будь-який з декількох пристроїв, що містять двовимірний масив малих кількостей біологічного матеріалу, що використовується для різних видів аналізів
    • ген репортера: ген, який дослідники приєднують до регуляторної послідовності іншого цікавого гена і продукт якого легко ідентифікувати в аналізах