17.3A: Стратегії, що використовуються в проектах секвенування

Last updated
Save as PDF

Page ID: 4738

Boundless
Boundless

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Стратегії, що використовуються для секвенування геномів, включають метод Сангера, секвенування дробовика, попарний кінець та секвенування наступного покоління.

Цілі навчання

Порівняйте різні стратегії, що використовуються для секвенування цілого генома: метод Сангера, секвенування дробовика, попарне секвенування та секвенування наступного покоління

Ключові моменти

Метод Сангера - це основна техніка секвенування, яка використовує флуоресцентно позначені дидезоксинуклеотиди (DDNTP) під час реплікації ДНК, що призводить до декількох коротких ниток реплікованої ДНК, які закінчуються в різних точках, на основі того, де був включений DDNTP.
Секвенування дробовика - це метод, який випадковим чином розрізає фрагменти ДНК на менші шматочки, а потім за допомогою комп'ютера бере фрагменти ДНК, аналізує їх на предмет перекриття послідовностей і повторно збирає всю послідовність ДНК.
Попарне секвенування - це тип секвенування дробовика, який використовується для великих геномів і аналізує обидва кінці фрагментів ДНК на предмет перекриття.
Секвенування наступного покоління - це тип секвенування, який автоматизований і спирається на складне програмне забезпечення для швидкого секвенування ДНК.

Ключові умови

флюорофор: молекула або функціональна група, яка здатна до флуоресценції
contig: сукупність перекриваються сегментів ДНК, отриманих з одного джерела генетичного матеріалу, з якого може бути виведена повна послідовність
дидезоксинуклеотид: будь-який нуклеотид, утворений з дезоксинуклеотиду шляхом втрати другої гідроксильної групи з групи дезоксирибози

Стратегії, що використовуються в секвенуванні проектів

Основною технікою секвенування, яка використовується у всіх сучасних проектах секвенування, є метод припинення ланцюга (також відомий як метод дідеокси), який був розроблений Фредом Сангером у 1970-х роках. Метод припинення ланцюга передбачає реплікацію ДНК однониткового шаблону з використанням праймера і звичайного дезоксинуклеотиду (dNTP), який є мономером, або єдиною одиницею ДНК. Праймер і dnTp змішуються з невеликою часткою флуоресцентно мічених дидезоксинуклеотидів (DDNTP). DDNTP - це мономери, у яких відсутня гідроксильна група (—OH) на місці, на якому інший нуклеотид зазвичай приєднується для формування ланцюга. Кожен DDNTP маркується різним кольором флюорофора. Кожен раз, коли DDNTP включений у зростаючу комплементарну нитку, він припиняє процес реплікації ДНК, що призводить до декількох коротких ниток реплікованої ДНК, які припиняються в іншій точці під час реплікації. Коли реакційна суміш обробляється гелевим електрофорезом після поділу на окремі нитки, множинні, щойно репліковані нитки ДНК утворюють сходи завдяки різним розмірам. Оскільки DDNTP флуоресцентно позначені, кожна смуга на гелі відображає розмір ланцюга ДНК та DDNTP, який припинив реакцію. Різні кольори флюорофорових маркованих DDNTP допомагають ідентифікувати DDNTP, включений у цьому положенні. Зчитування гелю на основі кольору кожної смуги на драбинці виробляє послідовність шаблону пасма.

зображення — Малюнок\(\PageIndex{1}\): Метод Сангера: Метод припинення дидеоксиланцюга Фредеріка Сангера використовує дидезоксинуклеотиди, в яких фрагмент ДНК може бути закінчений в різних точках. ДНК відокремлюється виходячи з розміру, і ці смуги, виходячи з розміру фрагментів, можна зчитувати.

Ранні стратегії: секвенування дробовика та парне секвенування кінця

У методі секвенування дробовика кілька копій фрагмента ДНК розрізаються випадковим чином на безліч дрібніших шматків (дещо схоже на те, що відбувається з патроном круглого пострілу при стрільбі з дробовика). Потім всі сегменти послідовні за допомогою методу ланцюгового секвенування. Потім за допомогою комп'ютера фрагменти аналізуються, щоб побачити, де їх послідовності перекриваються. За допомогою узгодження послідовностей, що перекриваються в кінці кожного фрагмента, можна реформувати всю послідовність ДНК. Більша послідовність, яка збирається з перекриваються коротших послідовностей, називається contig. Як аналогію вважайте, що хтось має чотири копії пейзажної фотографії, яку ви ніколи раніше не бачили, і нічого не знаєте про те, як вона повинна виглядати. Потім людина розриває кожну фотографію руками, так що з кожної копії присутні шматочки різного розміру. Потім людина змішує всі частини разом і просить вас реконструювати фотографію. В одному з менших шматочків ви бачите гору. У більшому шматку ви бачите, що та сама гора знаходиться за озером. На третьому фрагменті зображено лише озеро, але воно виявляє, що на березі озера є каюта. Тому, дивлячись на інформацію, що перекривається в цих трьох фрагментах, ви знаєте, що картина містить гору за озером, у якого на березі є будиночок. Це принцип реконструкції цілих послідовностей ДНК за допомогою секвенування дробовика.

Спочатку секвенування дробовика аналізувало лише один кінець кожного фрагмента на предмет накладок. Цього було достатньо для секвенування малих геномів. Однак прагнення до послідовності більших геномів, таких як людський, призвело до розвитку секвенування двоствольної рушниці, більш формально відомого як парне секвенування. При попарному послідовності обидва кінці кожного фрагмента аналізуються на перекриття. Тому парне послідовність є більш громіздким, ніж секвенування дробовика, але простіше реконструювати послідовність, оскільки є більше доступної інформації.

Послідовність наступного покоління

З 2005 року методи автоматизованого секвенування, що використовуються лабораторіями, знаходяться під парасолькою секвенування наступного покоління, яке є групою автоматизованих методів, що використовуються для швидкого секвенування ДНК. Ці автоматизовані, недорогі секвенсори можуть генерувати послідовності сотень тисяч або мільйонів коротких фрагментів (від 25 до 500 базових пар) протягом одного дня. Складне програмне забезпечення використовується для управління громіздким процесом приведення всіх фрагментів в порядок.