13.2: Штрих-кодування (активність)
Штрих-кодування ДНК зразків
- Помістіть зразок в чистий тюбик об'ємом 1,5 мл.
- Додайте 100 мкл розчину ядерного лізису в трубку.
- Закрутіть чистий пластиковий товкач до внутрішньої поверхні.
- Додайте 500 мкл більше розчину ядерного лізису в трубку.
- Інкубуйте трубку на водяній бані або тепловому блоці при 65°С протягом 5-15 хвилин.
- [Необов'язково] Додайте 200 мкл розчину для осадження білка в кожну трубку інкубувати на льоду протягом 5 хвилин.
- Центрифуга протягом 4 хвилин на максимальній швидкості, щоб гранулювати білок і клітинний сміття.
- Перенесіть 600 мкл супернатанту в чисту марковану трубку.
- Додайте 600 мкл ізопропанолу.
- Центрифуга протягом 2 хвилин на максимальній швидкості, щоб гранулювати ДНК.
- Злийте супернатант і додайте 600 мкл 70% етанолу, щоб промити гранулу.
- Центрифугуйте пробірку протягом 2 хвилин на максимальній швидкості і обережно видаліть розчин.
- Висушіть на повітрі гранули протягом 10 хвилин і додайте 100 мкл розчину регідратації ДНК (ТЕ).
- Інкубуйте ДНК при 65° C протягом 5-10 хвилин для розчинення.
- Отримайте ПЛР-пробірку, що містить готовий до роботи ПЛР-бісер. Позначте тюбик своїм ідентифікаційним номером.
- Використовуйте мікропіпетку зі свіжим наконечником, щоб додати 23 мкл однієї з наступних сумішей грунтовки/завантажувального барвника в кожну пробірку. Дайте кулькам розчинитися протягом 1 хвилини.
- Рослини: грунтовки RbCl (RBClaf/RbCla rev)
- Риба: праймери COI (VF2_T1/ Риба F2_T1/ Fishr2_T1/ FR1D_T1)
- Комахи: (ЛепФ1_Т1/ Лепр1_Т1)
- Додайте 2 мкл вашої ДНК безпосередньо у відповідну суміш грунтовки/завантажувального барвника.
- Помістіть трубки в термоциклер.
- Налийте 2% агарози в ливарний апарат в холодильнику.
- Потрібно було зробити 2 гелі на клас → 100 мл ТБЕ з 2г агарози
- Додайте 5 мкл безпечного розчину SYBR в розплавлену агарозу перед литтям.
- Помістіть 2 комплекти гребінців в гель → на одному кінці і посередині.
- Завантажте драбину ДНК та зразки ПЛР.
- Запустіть гель при 120В протягом 30 хвилин.
- Візуалізуйте на ультрафіолетовому трансілюмінаторі.
- Документ з камерою.
- Надіслати амплікони перевірених зразків для секвенування.
- Рослинний ген RbCl
- RBCLAF 5' - АТГТ КАКАКАА ААА ACAGA ААГК-3' (вперед грунтовка)
- RbClar 5'- ГТАААААТЦАГТК КСРКГ-3' (зворотна грунтовка)
- Ген монеток тварин
- LepF1 5' - АТЦА АККА АТТА АГАТА ТГГ -3 '(праймер вперед)
- Лепр1 5' - TAA АКТ ТГТГ ТГТК ЦАА АААААААА-3' (зворотна грунтовка)
- vf1f 5' - TCTCCAACCAACA ACCAA АГАТА ТТГГ-3' (праймер вперед)
- vf1r 5'- TAGACT CTCTGGGGGCCAA АГАААААААЦА-3' (зворотна грунтовка)