Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

13.2: Штрих-кодування (активність)

Штрих-кодування ДНК зразків

  1. Помістіть зразок в чистий тюбик об'ємом 1,5 мл.
  2. Додайте 100 мкл розчину ядерного лізису в трубку.
  • Закрутіть чистий пластиковий товкач до внутрішньої поверхні.
  1. Додайте 500 мкл більше розчину ядерного лізису в трубку.
  2. Інкубуйте трубку на водяній бані або тепловому блоці при 65°С протягом 5-15 хвилин.
  3. [Необов'язково] Додайте 200 мкл розчину для осадження білка в кожну трубку інкубувати на льоду протягом 5 хвилин.
  4. Центрифуга протягом 4 хвилин на максимальній швидкості, щоб гранулювати білок і клітинний сміття.
  5. Перенесіть 600 мкл супернатанту в чисту марковану трубку.
  6. Додайте 600 мкл ізопропанолу.
  7. Центрифуга протягом 2 хвилин на максимальній швидкості, щоб гранулювати ДНК.
  8. Злийте супернатант і додайте 600 мкл 70% етанолу, щоб промити гранулу.
  9. Центрифугуйте пробірку протягом 2 хвилин на максимальній швидкості і обережно видаліть розчин.
  10. Висушіть на повітрі гранули протягом 10 хвилин і додайте 100 мкл розчину регідратації ДНК (ТЕ).
  11. Інкубуйте ДНК при 65° C протягом 5-10 хвилин для розчинення.
  12. Отримайте ПЛР-пробірку, що містить готовий до роботи ПЛР-бісер. Позначте тюбик своїм ідентифікаційним номером.
  13. Використовуйте мікропіпетку зі свіжим наконечником, щоб додати 23 мкл однієї з наступних сумішей грунтовки/завантажувального барвника в кожну пробірку. Дайте кулькам розчинитися протягом 1 хвилини.
  • Рослини: грунтовки RbCl (RBClaf/RbCla rev)
  • Риба: праймери COI (VF2_T1/ Риба F2_T1/ Fishr2_T1/ FR1D_T1)
  • Комахи: (ЛепФ1_Т1/ Лепр1_Т1)
  1. Додайте 2 мкл вашої ДНК безпосередньо у відповідну суміш грунтовки/завантажувального барвника.
  2. Помістіть трубки в термоциклер.
  3. Налийте 2% агарози в ливарний апарат в холодильнику.
    1. Потрібно було зробити 2 гелі на клас → 100 мл ТБЕ з 2г агарози
    2. Додайте 5 мкл безпечного розчину SYBR в розплавлену агарозу перед литтям.
    3. Помістіть 2 комплекти гребінців в гель → на одному кінці і посередині.
  4. Завантажте драбину ДНК та зразки ПЛР.
  5. Запустіть гель при 120В протягом 30 хвилин.
  6. Візуалізуйте на ультрафіолетовому трансілюмінаторі.
  7. Документ з камерою.
  8. Надіслати амплікони перевірених зразків для секвенування.
  • Рослинний ген RbCl
    • RBCLAF 5' - АТГТ КАКАКАА ААА ACAGA ААГК-3' (вперед грунтовка)
    • RbClar 5'- ГТАААААТЦАГТК КСРКГ-3' (зворотна грунтовка)
  • Ген монеток тварин
    • LepF1 5' - АТЦА АККА АТТА АГАТА ТГГ -3 '(праймер вперед)
    • Лепр1 5' - TAA АКТ ТГТГ ТГТК ЦАА АААААААА-3' (зворотна грунтовка)
    • vf1f 5' - TCTCCAACCAACA ACCAA АГАТА ТТГГ-3' (праймер вперед)
    • vf1r 5'- TAGACT CTCTGGGGGCCAA АГАААААААЦА-3' (зворотна грунтовка)