Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

27.6: Секвенування ДНК

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    22781

    • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

    Ми обговоримо один метод читання послідовності ДНК. Цей метод, розроблений Сенгером, завоював йому другу Нобелівську премію. Для послідовності одного багатониткового шматочка ДНК синтезується комплементарна нитка. Встановлено чотири різні реакційні суміші. Кожен містить всі 4 необхідні для реакції радіоактивні дезоксинуклеотиди (DaTP, DCTP, dTTP), необхідні для реакції і ДНК-полімеразу. Крім того, DiDeoxyATP (DDATP) додається до однієї реакційної трубки DatP і DDatP випадковим чином приєднуються до зростаючого 3-футового кінця комплементарного багатожильного. Якщо додається dDatP, подальші нуклеотиди не можуть бути додані після того, як його 3' кінець має H, а не OH. Саме тому вони називають його дідеокси. Новий ланцюг припиняється.. Якщо буде додано DatP, ланцюг буде продовжувати рости, поки не буде потрібно додати ще один A. Отже, буде зроблена ціла серія дискретних фрагментів ланцюгів ДНК, всі вони припинені, коли було додано DDatP. Той самий сценарій відбувається для інших 3 труб, які містять dCTP і DdCtp, DTTP і DDTTP, а також dGTp і DDGTp відповідно. Всі фрагменти, зроблені в кожній трубці, будуть поміщені в окремі смуги для електрофорезу, де фрагменти будуть відокремлюватися за розміром.

    Дідексоїнуклеотиди

    альт
    Малюнок: Дідексонуклеотиди

    01dideoxyNTP.gif

    Приклад

    Ви будете робити вигляд, що послідовно один багатонитковий шматок ДНК, як показано нижче. Нові нуклеотиди додаються ферментом ДНК-полімеразою до праймера, GACT, у напрямку 5' до 3'. Ви встановите 4 реакційні трубки, кожна трубка містить всі Dxtp. Крім того, додайте DDatP до трубки 1, DdTtp до трубки 2, DdCTp до трубки 3 та ddGTp до трубки 4. Для кожної окремої реакційної суміші визначте всі можливі послідовності, зроблені шляхом запису можливих послідовностей на одній з незакінчених комплементарних послідовностей нижче. Виріжте завершені послідовності зі сторінки, визначте розмір зроблених полінуклеотидних послідовностей та розмістіть їх так, як вони мігрували (залежно від розміру) у відповідній смузі уявного гелю, який ви намалювали на аркуші паперу. Провулок 1 буде містити нуклеотиди, зроблені в трубці 1 і т.д. потім намалюйте лінії під положеннями вирізу нуклеотидів, щоб представляти смуги ДНК в гелі. Прочитайте послідовність синтезованої комплементарної ДНК. Потім напишіть послідовність SSDNA, яка повинна була бути секвенована.

    • 5' T C A C A C G A T C T G A 3' (СТОЯТИ ДО ПОСЛІДОВНОСТІ)
    • 3' Г А С Т 5' (грунтовка)
    • 3' Г А С Т 5' (грунтовка)
    • 3' Г А С Т 5' (грунтовка)
    • 3' Г А С Т 5' (грунтовка)
    • 3' Г А С Т 5' (грунтовка)
    • 3' Г А С Т 5' (грунтовка)
    • 3' Г А С Т 5' (грунтовка)
    • 3' Г А С Т 5' (грунтовка)

    Оскільки фрагменти ДНК не мають виявленого кольору, їх неможливо безпосередньо візуалізувати в гелі. Використовуються альтернативні методи. У описаному вище, радіомаркований DDXtp, де використовується. Після запуску гелю для секвенування його можна висушити та візуалізувати смуги за допомогою радіоаутографії (також званої авторентгенографією). Місце рентгенівської плівки поміщають поверх висохлого гелю в темному середовищі. Радіомарковані смуги випромінюватимуть випромінювання, яке буде оголювати рентгенівську плівку безпосередньо над смугами. Фільм може бути розроблений для виявлення смуг. У новішій техніці праймер можна маркувати флоуресцирующим барвником. Якщо для кожної реакційної суміші використовується інший барвник, всі реакційні суміші можна запускати в одній смузі гелю. (Насправді потрібно виконати лише одну реакційну суміш, що містить всі разом DDXtp.) Потім гель може бути відсканований лазером, який виявляє флуоресценцію з барвників, кожен на різній довжині хвилі.

    альт
    Малюнок: Секвенування ДНК з використанням різних флуоресцентних праймерів для кожної реакції DDxTP

    Один недавній прогрес у секвенуванні дозволяє в режимі реального часу визначити послідовність. Чотири дезоксинуклеотиди позначені різним фторфором на 5' фосфаті (не основа, як зазначено вище). Прив'язана ДНК-полімераза подовжує ДНК на шаблоні, вивільняючи флюорофор у розчин (тобто флуорофор не включений в ланцюг ДНК). Реакція відбувається в камері візуалізації, яка називається хвилеводом нульового режиму, який представляє собою циліндричну металеву камеру шириною 70 нм і об'ємом 20 цептолітрів (20 х 10-21 л). Він сидить на скляній опорі, за допомогою якої досягається лазерне освітлення зразка. Враховуючи малий об'єм, невбудовані флуоресцентно позначені дезоксинуклеотиди дифузно в мікросекундному часовому масштабі. Коли дезоксинуклеотид включений в ДНК, час його перебування знаходиться в мілісекундній шкалі часу. Це дозволяє тривалий виявлення флуоресценції, які дають високе співвідношення сигнал/шум. Цей метод може призвести до зниження вартості секвенування генома людини від початкового діапазону мільярда доларів до 100 доларів.

    02dnasequencing.GIF