Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

3.4: Різні аналізи цитотоксичності

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    24609

    \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

    Цілі навчання
    • 1: Знайте різні типи аналізів цитотоксичності.
    • 2: Знайте, як використовуються різні аналізи цитотоксичності, коли клітини піддаються впливу токсикантів або мутагенів.

    Мета аналізу цитотоксичності полягає в тому, щоб визначити, чи будь-які хімічні речовини або препарати будуть робити будь-який токсичний ефект або навантаження на середовище або генетичний матеріал клітин, спричинених летальністю клітин або викликані різними захворюваннями.

    Нижче наведено різні типи аналізів цитотоксичності:

    • ДНК-фрагментація/сходовий аналіз
    • Аналіз комети
    • Аналіз на некроз
    • ферментний аналіз
    • Протеомічний аналіз
    • Аналіз масиву виразів

    4.1: Фрагментація ДНК та аналіз сходів

    Фрагментація ДНК або сходовий аналіз використовуються для того, щоб знати фрагментовану ДНК клітин, викликану хімічними речовинами або наркотиками. Фрагментована ДНК може бути відокремлена електрофорезом агарозного гелю і може бути візуалізована як «сходи» шляхом фарбування бромідом етидію. Оцінка цитотоксичності через загибель клітин є прийнятною загальною оцінкою.

    Сходові проби виконуються з наступних причин:

    1. просто охарактеризувати токсичність хімічних речовин або наркотиків у клітині, або
    2. визначити максимальні дози досліджуваних хімічних речовин або препаратів, які можуть бути використані для клітин, не викликаючи занадто великої загибелі клітин.
    ДНК-сходи. Нуклеотидна базова пара згадується як «bp».
    Малюнок\(\PageIndex{1}\): ДНК-драбинка. Нуклеотидна базова пара згадується як «bp».

    4.2: Аналіз комети

    Comet Assay (одноклітинний гель-електрофорез/SCGE) використовується для виявлення пошкодження ДНК за допомогою мікрогелевого електрофорезу. На зображенні пошкодженої ДНК зображена комета з головою і хвостом. Аналіз зображення для кометного аналізу розрахований для «довжини хвоста» комети, яка є вимірюванням з точки найвищої інтенсивності всередині голови комети, а також «хвостового моменту», який є добутком довжини хвоста та частки загальної ДНК, присутньої всередині хвоста.

    Аналіз комети показав кількість пошкодженої ДНК кометним хвостовим моментом.
    Малюнок\(\PageIndex{2}\): Аналіз комети показав кількість пошкодженої ДНК кометним хвостовим моментом.

    4.3: Аналіз на некроз

    Аналіз некрозу проводиться методом проточної цитометрії з фарбуванням анексіну V та йодиду пропідію (PI) в клітині. Клітини розглядаються в стадії некрозу, якщо клітини втрачають цілісність мембрани і швидко гинуть внаслідок лізису клітин при впливі хімічних речовин, ліків, токсинів або чужорідних антигенів. При некрозі клітини виявляють набряклість, втрату цілісності мембрани і порушення обміну речовин. Клітини з некрозом не переходять в стадію апоптозу, апоптотична клітина може піддаватися вторинному некрозу. Ці некротичні клітини припиняють метаболізм, втратять цілісність мембрани, лізу та аутоліз травми сформованих клітин.

    Проточний цитометричний аналіз для аналізу некрозу показав, що клітини, забарвлені позитивно як для FITC Annexin V, так і PI знаходяться в кінцевій стадії апоптозу і перебувають на стадії некрозу, оскільки мертві клітини забарвлені PI позитивно. Клітини, які забарвлюють негативні як для FITC Annexin V, так і PI, живі і не зазнають апоптозу або некрозу.

    Проточний цитометричний аналіз клітин, що показує стадію некрозу.
    Малюнок\(\PageIndex{3}\): Проточний цитометричний аналіз клітин, що показують стадію некрозу.

    4.4: Ферментний аналіз

    Ферментний аналіз використовується для контролю проходження лактатдегідрогенази (ЛДГ), внаслідок втрати цілісності клітинної мембрани при впливі на клітини цитотоксичних сполук. ЛДГ зменшує NAD до NADH, що генерує зміну кольору шляхом взаємодії з конкретним зондом (рис. 4а). В іншому ферментному аналізі аналіз на основі аденозинтрифосфату (АТФ) у поєднанні з біолюмінесцентним аналізом використовуються для вимірювання цитотоксичності клітин, в яких АТФ є реагентом для реакції люциферази.

    Схематичне уявлення ферментного аналізу. (а) ЛДГ аналіз (б) Аналіз на основі АТФ
    Малюнок\(\PageIndex{4}\): Схематичне представлення ферментного аналізу. (а) ЛДГ аналіз (б) Аналіз на основі АТФ

    4.5: Протеомічний аналіз

    Протеомний аналіз проводиться, щоб знати механізм клітинної токсичності шляхом вимірювання експресії конкретного білка, який може розглядатися як біомаркер для конкретного токсичного механізму або сигнального шляху клітинної токсичності. Імунофлюоресценція, імуноосадження та імуноблотний аналіз в основному використовуються для знання ефекту токсикантів у сигнальному шляху або механізмі клітинної токсичності.

    Схематичне представлення протеомного аналізу.
    Малюнок\(\PageIndex{5}\): Схематичне представлення протеомного аналізу.

    4.6: Аналіз масиву виразів

    Експресійний масив - це мікромасив на основі мікросхем більшої кількості генних виразів (відбиток пальців генів) за дією клітинних токсикантів. Це швидкий і чутливий метод виявлення, який дозволяє виявити всі токсикологічні кінцеві точки в широкому діапазоні змін молекулярного рівня в клітині при одночасному аналізі. Процес мікромасиву можна розділити на дві основні частини. По-перше, друк відомих послідовностей генів на скляні слайди або іншу тверду опору з подальшою гібридизацією флуоресцентно міченої кДНК (що містить невідомі послідовності, які потрібно опитувати) до відомих генів, іммобілізованих на скляному слайді. Після гібридизації масиви скануються за допомогою флуоресцентного мікроматричного сканера. Аналіз відносної флуоресцентної інтенсивності різних генів забезпечує вимір відмінностей у експресії генів.

    Схематичне зображення масиву експресії генів показало, що Cy5 (червоний) і Cy3 (зелений) мічені кДНК гібридизовані до мікромасиву ДНК. Жовті плями вказують на те, що гени виражені в обох зразках. Інтенсивність і різні типи кольору на кожній плямі вказують на рівень і наявність генів у зразках. Чорні плями показують низький рівень експресії або не показують жодної експресії генів.
    Малюнок\(\PageIndex{6}\): Схематичне зображення масиву експресії генів показало, що Cy5 (червоний) та Cy3 (зелений) мічені кДНК гібридизовані до мікромасиву ДНК. Жовті плями вказують на те, що гени виражені в обох зразках. Інтенсивність і різні типи кольору на кожній плямі вказують на рівень і наявність генів у зразках. Чорні плями показують низький рівень експресії або не показують жодної експресії генів.

    Тема 4: Ключові моменти

    У цьому розділі ми вивчили наступні основні моменти:

    • 1: Різні типи аналізів цитотоксичності.
    • 2: Як різний аналіз цитотоксичності, а саме фрагментація ДНК, аналіз сходів, аналіз комети, аналіз некрозу, ферментний аналіз, протеомічний аналіз та аналіз масиву експресії використовуються, коли клітини піддаються впливу цитотоксичних агентів.
    Перевірка знань

    1. Клітини розглядаються в стадії некрозу, якщо клітини втрачають цілісність мембрани і швидко гинуть внаслідок лізису клітин при впливі хімічних речовин, ліків, токсинів або чужорідних антигенів.

    Правда

    Помилковий

    Відповідь

    Правда

    2. Аналіз комети використовується для виявлення пошкодження ДНК за допомогою мікрогелевого електрофорезу:

    Правда

    Помилковий

    Відповідь

    Правда

    3. Експресійний масив - це мікромасив на основі мікросхем більшої кількості генних виразів (відбиток пальців генів) за дією клітинних токсикантів.

    Правда

    Помилковий

    Відповідь

    Правда

    4. Сходовий аналіз проводиться з наступних причин: 1) просто охарактеризувати токсичність хімічних речовин або наркотиків у клітині, або 2) визначити максимальні дози досліджуваних хімічних речовин або препаратів, які можуть бути використані для клітин, не викликаючи занадто великої загибелі клітин.

    Правда

    Помилковий

    Відповідь

    Правда

    5. Які протеомні аналізи, щоб знати вплив токсикантів у клітинному шляху або механізмі сигналізації токсичності?

    Імунофлюоресцентний аналіз

    дзвонити

    Аналіз на імуноосадження

    Імуноблот аналіз

    Все вищесказане

    Відповідь

    Все вищесказане