17.2: Піридоксальфосфат (вітамін B6)

Коензим піридоксальфосфат (зазвичай скорочено PLP) є активною формою вітаміну\(B_6\), або піридоксину.

PLP необхідний для більш ніж 100 різних реакцій в метаболізмі людини, в першу чергу в різних амінокислотних біосинтетичних і деградаційних шляхах. Основна функція PLP - діяти як «електронна раковина», стабілізуючи негативний формальний заряд, який розвивається на ключових проміжних продуктах реакції. Деякі реакції будуть вам знайомі з розділів 12 та 13, ми побачимо приклади, наприклад, -dependent\(\alpha \)-carbon racemization, as well as aldol- and Claisen-type reactions. Other reactions will be less familiar: for example, the participation of allows for decarboxylation of amino acids, a chemical step which would be highly unlikely without the coenzyme, and PLP is also required for a very important class of biochemical transformation called 'transamination', in which the amino group of an amino acid is transferred to an acceptor molecule. Before we dive into the reactions themselves, though, we need to begin by looking at a key preliminary step that is common to all of the PLP reactions we will see in this section.

PLP in the active site: the imine linkage

The common catalytic cycle of a PLP-dependent enzyme begins and ends with the coenzyme covalently linked to the enzyme's active site through an imine linkage between the aldehyde carbon of PLP and the amine group of a lysine residue (see section 10.5 to review the mechanism for imine formation). For a PLP-dependent enzyme to become active, a PLP molecule must first enter the active site of an enzyme and form an imine link to the lysine. This state is often referred to as an external aldimine.

Першим етапом практично всіх PLP-залежних реакцій є транзимінація (розділ 10.5), так як аміногрупа на амінокислотному субстраті витісняє аміногрупу ферментативного лізину. Цей стан - де коензим ковалентно пов'язаний з субстратом або продуктом реакції - часто називають внутрішнім альдиміном.

Після завершення попередньої транзимінації справжня хімія PLP готова до початку. Універсальність PLP з точки зору його здатності допомагати з найрізноманітнішими типами реакцій ілюструється на малюнку нижче, показуючи, як, залежно від відповідної реакції/ферменту, PLP може сприяти розщепленню будь-якої з чотирьох зв'язків до\(\alpha \)-carbon of the amino acid substrate.

Давайте спочатку розглянемо реакцію, каталізовану PLP-залежною аланіновою рацемазою. (Д. 5.1.1.1).

PLP-залежна амінокислота рацемізація

У розділі 12.2 ми побачили приклад реакції рацемізації амінокислот, незалежної від PLP, в якій негативно заряджений проміжний продукт був просто енолатной формою карбоксилатена:

Однак багато інших амінокислотних реакцій рацемази вимагають участі PLP.

Як і всі інші PLP-залежні реакції, які ми побачимо в цьому розділі, PLP-залежна амінокислота рацемізація починається з попереднього етапу, на якому субстрат приєднується до коферменту шляхом транзимінації. Після того, як він пов'язаний з PLP на активному сайті, a-протон амінокислотного субстрату абстрагується активною базою сайту (крок 1 нижче). Негативний заряд на проміжному карбоніоні може, звичайно, делокалізуватися в карбоксилатну групу. Однак коензим PLP забезпечує розширену мережу кон'югованих\(\pi \)-bonds over which the electron density can be delocalized all the way down to the PLP nitrogen. This is what we mean when we say that the job of PLP is to act as an ‘electron sink’: the coenzyme is very efficient at absorbing, or delocalizing, the excess electron density on the deprotonated \(\alpha \)-carbon of the reaction intermediate. PLP is helping the enzyme to increase the acidity of the \(\alpha \)-hydrogen by stabilizing the conjugate base. A PLP-stabilized carbanion intermediate is commonly referred to as a quinonoid intermediate. Note that in the overall reaction equation below, PLP appears below the reaction arrow in brackets, indicating that it participates in the mechanism but is regenerated as part of the reaction cycle.

PLP-dependent amino acid racemization:

Mechanism:

Preliminary step - transimination

First step - deprotonation:

Second step - reprotonation from the opposite side:

Final step - transimination:

Just as in the PLP-independent racemase reactions, reprotonation occurs on the opposite side of the substrate (step 2), leading to the \(D\)-amino acid product.

All that remains is the final imine exchange which frees the \(D\)-amino acid product and re-attaches the coenzyme to the enzymatic lysine side-chain, ready to begin another catalytic cycle.

To simplify matters, from here on we will not include the preliminary and final transimination steps in our PLP reaction figures - we will only show mechanistic steps that occur while the substrate is attached to the coenzyme (the internal aldimine forms).

PLP-dependent decarboxylation

In the amino acid racemase reaction above, PLP assisted in breaking the \(\alpha \)-carbon to \(\alpha \)-proton bond of the amino acid. Other PLP-dependent enzymes can catalyze the breaking of the bond between the \(\alpha \)-carbon and the carboxylate carbon by stabilizing the resulting carbanion intermediate: these are simply decarboxylation reactions.

PLP-depended amino acid decarboxylation:

Mechanism:

Notice something very important here: while in racemization reactions the assistance of PLP can be seen as 'optional' (in the sense that some racemase enzyme use PLP and others do not), the coenzyme is essential for amino acid decarboxylation steps. Without PLP, there is no way to stabilize the carbanion intermediate, and decarboxylation is not a chemically reasonable step.

Одним із прикладів реакції декарбоксилювання, що полегшується PLP, є завершальним етапом шляху біосинтезу лізину: (EC 4.1.1.20).

Вправа Template:index

Намалюйте механістичні стрілки для кроку розриву вуглецево-вуглецевого зв'язку PLP-залежної реакції декарбоксилювання вище.

PLP-залежний ретроальдол і ретро-клайзен розщеплення

(Було б гарною ідеєю перед читанням цього розділу переглянути механізми реакції aldol/retro-aldol та Claisen/Retro-Claisen відповідно в розділах 12.3 та 13.3)

Поки ми бачили, як PLP відіграє певну роль у розриві зв'язку між\(\alpha \)-carbon and its \(\alpha \)-proton (in the racemization reaction), and the bond between the \(\alpha \)-carbon and carboxylate carbon (in the decarboxylation reaction).

Інші PLP-залежні ферменти каталізують розщеплення зв'язку між\(\alpha\) -вуглецем і першим вуглецем на бічному ланцюзі амінокислот, інакше відомий як\(\beta \) -вуглець. У шляху деградації серину серин спочатку перетворюється на гліцин реакцією розщеплення ретро-альдолу. (). Хоча розумний механізм може бути запропонований без участі PLP, ця реакція насправді вимагає коферменту для сприяння стабілізації негативного заряду на проміжному карбоніоні.

Реакція ретро-альдольного розщеплення PLP

(серингідроксиметилтрансфераза, ЕС 2.1.2.1)

Механізм:

Зауважте, що в цій реакції так само, як і в реакції рацемази, описаної раніше, ключовим проміжним продуктом є PLP-стабілізований карбоніон, або хіноноїд.

Що відбувається з (токсичним!) формальдегід, що утворюється в цій реакції? Пізніше в цьому розділі ми побачимо, як фермент серингідроксиметилтрансферази продовжує використовувати інший кофермент під назвою тетрагідрофолат, щоб запобігти виходу формальдегіду з активної ділянки та спричиненню пошкодження клітини.

PLP також допомагає в реакціях розщеплення ретро-клайсена (розділ 13.3), таких як цей етап деградації треоніну. (СЕК. 2.3.1.29)

Реакція ретро-клайзена, залежна від ПЛП:

Механізм:

Зверніть увагу, як, як ретро-альдольна реакція, зв'язок між\(\alpha \) -вуглецем і\(\beta \) -вуглецем амінокислотного субстрату порушується (на етапі 1b).

PLP-залежна трансамінація

Одним з найважливіших типів реакцій в метаболізмі амінокислот є трансамінація, при якій аміногрупа на молекулі донора (часто амінокислота) переноситься в молекулу акцептора кетону або альдегіду.

Реакція трансамінування:

Фаза трансамінування 1 (перенесення аміногрупи з амінокислотного субстрату в коензим)

Механізм:

Ще раз, крок 1 - це абстрагування\(\alpha \) -протона з аддукта PLP-субстрату. Однак у реакції трансаміназ цей початковий етап депротонації негайно супроводжується репротонацією при тому, що спочатку був альдегідним вуглецем PLP (крок 2 вище), що призводить до нового подвійного зв'язку вуглець-азоту (іншими словами, імін) між\(\alpha \) -вуглецем і атомом азоту оригінальна амінокислота. Потім репозитовану імінову групу гідролізують (крок 3 вище), розриваючи зв'язок вуглець-азот, передаючи аміногрупу коферменту та вивільняючи\(\alpha \) -кетокислоту.

Кофермент, який зараз несе амінну групу і називається піридоксамінфосфат (\(PMP\)), далі переводить амінну групу в\(\alpha \) -кетоглутарат (для утворення глутамату) через розворот всього процесу, зображеного вище.

Реакція трансамінування, фаза 2

(перенесення аміногрупи з коензиму в молекулу акцептора)

Механізм:

див. вправу нижче

У реакції трансамінування коензим PLP не тільки забезпечує раковину електронів, він також служить тимчасовим «паркувальним місцем» для аміногрупи, оскільки він передається від донора до акцептора.

Вправа Template:index

Показати повний, покроковий механізм для «фази 2» реакції трансамінації вище.

Ось приклад реакції трансамінування в шляху біосинтезу аргініну: EC 2.6.1.11

Вправа Template:index

1. Намалюйте стрілки для першого механістичного кроку «фази 2» вищевказаної реакції трансаміназ.
2. Який вуглець на стороні субстрату реакції врешті-решт стане\(\alpha \)-carbon of arginine?

Exercise Template:Index

Propose a pathway, with three enzymatic steps, for the biosynthesis of serine from 3-phosphoglycerate. Include a generalized ('-ase') enzyme name for each step. Glutamate plays a role in the process as an amino group donor.

PLP-dependent \(beta \)-elimination and \(\beta \)-substitution

(Before starting this section, it would be a good idea to review \(E1cb\) \(\beta \)-elimination and conjugate addition reaction mechanisms in section 13.4)

By now it should be pretty apparent that PLP is a pretty versatile coenzyme! Two more reaction types in the PLP toolbox are \(\beta \)-elimination and \(\beta \)-substitution on amino acid substrates.

In a PLP-dependent \(\beta \)-elimination reaction, the coenzyme simply helps to stabilize the carbanion intermediate of the \(E1cb\) mechanism:

PLP-dependent \(\beta \)-elimination reaction

Mechanism:

Serine dehydratase (EC 4.2.1.13) catalyzes a PLP-dependent \(\beta \)-elimination in the first step of the serine degradation pathway:

Реакція\(\beta \) -заміщення - це просто\(E1cb\) елімінація, за якою слідує безпосередньо зворотна реакція (приєднання кон'югатів) з іншим нуклеофілом (Y на малюнку нижче):

Реакція\(\beta \) -заміщення:

У багатьох бактерій синтез цистеїну з серину включає\(\beta \) PLP-залежну стадію заміщення (ЕС 2.5.1.47).

Вправа Template:index

Намалюйте механізм для кон'югатної фази приєднання реакції вище (закінчуйте аддуктом цистеїн-PLP).

ПЛП-залежний\(\gamma \)-elimination and \(\gamma \)-substitution reactions

The electron sink capability of PLP allows some enzymes to catalyze eliminations at the \(\gamma \)-carbon of some amino acid side chains, rather than at the \(\beta \)-carbon. secret to understanding the mechanism of a \(\gamma \)-elimination is that PLP essentially acts as an electron sink twice - it absorbs the excess electron density from not one but two proton abstractions.

\(\gamma \)-elimination

Mechanism:

In a familiar first step, the \(\alpha \)-proton of the amino acid is abstracted by an enzymatic base, and the electron density is absorbed by PLP. Next comes the new part - before anything happens to the electron density from the first proton abstraction, a second proton, this time from the \(\beta \)-carbon on the side chain, is abstracted, forming an enamine intermediate (step 2). The phenolic proton on the pyridoxal ring of PLP donates a proton to the nitrogen. step 3, the leaving is expelled and a new \(\pi \)-bond forms between the \(\beta \) and \(\gamma \) carbons (step 3). This \(\pi \)-bond is short-lived, however, as the electron density from the first proton abstraction, which has been 'stored' in PLP all this time, flows back up to protonate the \(\alpha \)-carbon (step 4), leaving the \(\gamma \)-elimination product linked to PLP via the usual imine connection.

An example is the cystathionine \(\gamma \)-lyase reaction in the methionine degradation pathway (EC 4.4.1.1):

рис. 2

Пов'язаною реакцією є PLP-залежна\(\gamma \) -заміщення, яка знову ж таки просто\(\gamma \) -елімінація виїжджаючої групи (X на малюнку нижче) з подальшим безпосередньо зворотним процесом (a\(\gamma \) -додавання) з іншим нуклеофілом ('Nu' на малюнку нижче).

PLP-залежне\(\gamma \) -заміщення:

Механізм:

Нижче наведено\(\gamma \) PLP-залежну реакцію заміщення на шляху деградації метіоніну (EC 4.2.1.22):

Рацемаза до альдолази: зміна перебігу реакції ПЛП

Ми бачили, як PLP-залежні ферменти каталізують різноманітні типи реакцій - рацемізація, ретроальдол/ретро-клайзен розщеплення, трансамінамінація, елімінація та заміщення - які, незважаючи на їх очевидну різноманітність, всі характеризуються утворенням критичного проміжного продукту карбоніону, який стабілізується властивість «електронної раковина» коферменту PLP. Враховуючи цю загальну механістичну особливість, було б розумно припустити, що архітектура активного сайту цих ферментів також може бути досить близькою. Ця ідея була добре проілюстрована експериментом, в якому дослідники виявили, що зміна однієї активної амінокислоти PLP-залежної аланінової рацемази була достатньою, щоб перетворити її на ретро-альдолазу (J. Am. Хім. Соц. 2003, 125, 10158).

У реакції «дикого типу» (природний) аланін рацемази активний сайт гістидин (червоний на малюнку нижче) депротонує сусідній залишок тирозину (синій), який, в свою чергу, діє як каталітична основа абстрагуючи\(\alpha \)-proton of the substrate. When researchers changed the tyrosine to an alanine (using a technique called 'site-directed mutagenesis'), and substituted \(\beta \)-hydroxytyrosine for the alanine substrate, the new 'mutant' enzyme catalyzed a retro-aldol reaction.

Зверніть увагу, що сталося тут: основний гістидин, без тирозину депротонувати через мутацію, замість цього позиціонується для абстрагування протона з\(\beta \) -гідроксильної групи нового субстрату, встановлюючи ретроальдол розщеплення. Це було все, що потрібно, щоб змінити рацемазу на ретроальдолазу, тому що необхідна PLP система електронного миття була залишена на місці. Дослідники правильно передбачили, що фенільне кільце\(\beta \) -гідрокситирозину буде добре вписуватися в простір, що залишився порожнім через зміну тирозину до аланіну в структурі мутантного ферменту

Ці результати підкреслюють тісний механістичний зв'язок між двома PLP-залежними реакціями, які, на перший погляд, здаються досить різними - і припускають, що PLP-залежні рацемази та альдолази, можливо, еволюціонували із загального ферменту «предка».

Стереоелектронні міркування ПЛП-залежних реакцій

Нагадаємо, що всі PLP-залежні реакції передбачають розщеплення однієї з зв'язків, що надходять з\(\alpha \) -вуглецю амінокислотного субстрату, при цьому кофермент служить «електронним потоком» для стабілізації проміжного продукту, що призводить. PLP-залежні ферменти прискорюють цей крок розриву зв'язку, зв'язуючи аддукт субстрату-PLP в конформації такий, що зв'язок, що розривається, близький до перпендикулярно площині, утвореній кон'югованою\(\pi \) системою PLP: таким чином, як\(\alpha \) -вуглецеві переходи від\(sp^3\) до\(sp^2\) гібридизація, негібридизована\(\pi \) орбітальна вже орієнтована на перекриття з іншою частиною кон'югованої системи. Наприклад, у аланінової рацемази першим кроком є розщеплення\(C\alpha -H\) зв'язку, тому це повинен бути той зв'язок, який розташований майже перпендикулярно площині PLP:

Так само в амінокислотній декарбоксилазі\(C\alpha \)-carboxylate bond is held near-perpendicular to the PLP plane, and in hydroxymethyltransferase, the \(C\alpha -C\beta \) bond is in the perpendicular orientation:

These are all good examples of how enzymatic catalysis is achieved, in part, by the ability of the active site to bind the substrate molecule in a specific conformation which contributes to the lowering of the activation energy of a key reaction step.