25.9: Ферменти

Практично всі біохімічні реакції каталізуються білками, званими ферментами. Каталітична сила і специфічність ферментів надзвичайно високі. Реакції, які вони каталізують, як правило, посилюються в швидкості на багато порядків, часто стільки ж, скільки\(10^7\), над неферментативним процесом. Отже, ферментативні реакції можуть відбуватися в набагато більш м'яких умовах, ніж порівнянні лабораторні реакції. Наприклад, простий гідроліз аміду протікає з практичною швидкістю тільки при нагріванні аміду або в сильно кислому, або сильно основному водному розчині, і навіть тоді реакція може бути не повною протягом декількох годин. На відміну від цього, гідроліз амідних або пептидних зв'язків, каталізованих типовими протеолітичними ферментами, такими як трипсин, хімотрипсин або карбоксипептидаза А, відбувається швидко у вигляді фізіологічних температур і фізіологічного рН. \(^7\)Це один з чудових атрибутів багатьох ферментів, що вони каталізують реакції, які в іншому випадку потребують сильнокислих або основних умов. Однак ферменти є строго каталізаторами і впливають тільки на швидкість реакції, а не положення рівноваги; вони знижують енергію перехідного стану, а не енергії реагентів або продуктів (див. Рис.

Багато ферментів, здається, спеціально розроблені для однієї конкретної реакції, що включає лише один реагент, який називається субстратом. Інші можуть функціонувати більш загально з різними реагентами (субстратами). Але не існує такого поняття, як універсальний фермент, який робить все для всіх субстратів. Однак ніщо, здається, не залишається випадковим; навіть врівноваження вуглекислого газу з водою досягається за допомогою ферменту, відомого як карбоангідрази. \(^8\)Зрозуміло, що сфера хімії ферментів величезна, але структура та функція відносно небагатьох ферментів зрозумілі в будь-яких деталах. Ми можемо навести тут лише коротке обговорення механізмів дії ферментів - спочатку якісь загальні принципи, потім якісь конкретні приклади.

Аспекти механізмів ферментних реакцій

Фермент зазвичай каталізує одну хімічну операцію в дуже конкретному положенні, а це означає, що тісно бере участь лише невелика частина ферменту. Область ферментної структури, де відбуваються ключові реакції в результаті асоціації субстрату з ферментом, називається активною ділянкою. Початковою асоціацією ферменту\(\left( \ce{E} \right)\) і субстрату\(\left( \ce{S} \right)\) є утворення ферментно-субстратного комплексу\(\left( \ce{ES} \right)\):

\[\ce{E} + \ce{S} \rightleftharpoons \ce{ES}\]

Комплексоутворення може відбуватися різними способами, але для інтимного комплексоутворення, необхідного для каталізу, фермент повинен мати або повинен мати можливість припускати форму, що доповнює форму субстрату. Спочатку вважалося, що субстрат вписував фермент дещо як ключ у замок; ця концепція була змінена в останні роки до теорії індукованої посадки, завдяки якій фермент може адаптуватися до підкладки, зазнаючи конформаційні зміни (рис. 25-18). Крім того, субстрат може бути аналогічно індукований, щоб відповідати ферменту. Комплементарність тривимірна, важливий фактор визначення специфічності ферментів до структури і стереохімічної конфігурації субстратів.

Малюнок 25-18: Ілюстрація концепції блокування та ключа взаємодії ферментів з субстратом (зверху) та теорії індукованої посадки, за допомогою якої фермент формується до субстрату через конформаційні зміни (знизу).

Детальні структури для активних ділянок ферментів важко отримати і були розроблені лише для декількох ферментів, які були широко вивчені як хімічним, так і рентгенівським методами. Дуже показову інформацію було отримано при рентгенівських дифракційних дослідженнях комплексів між ферментом і несубстратами, які є молекулами, подібними до фактичних субстратів і комплексними з ферментом на активній ділянці, але не реагують далі. Ці речовини часто пригнічують реакцію нормального субстрату, сильно асоціюючись з ферментом на активному місці і не рухаючись далі до продуктів. Рентгенівські дослідження ферментів в комплексі з несубстратами показують, що активний сайт, як правило, являє собою ущелину або порожнину в складеній структурі ферменту, який в значній мірі гідрофобний характер. Ферментно-субстратний комплекс можна зробити висновок, що він утримується разом значною мірою за допомогою привабливих сил ван дер Ваальса між подібними групами (Розділ 12-3C), водневим зв'язком та електростатичним притяганням між іонними або полярними групами. Щоб досягти стереоспецифічної каталізованої реакції, має бути принаймні три точки таких взаємодій, щоб правильно вирівняти субстрат всередині порожнини ферменту.

Реакція\(\ce{ES}\) комплексу може перетворити субстрат в продукт\(\left( \ce{P} \right)\) безпосередньо, і одночасно звільнити фермент,\(\left( \ce{E} \right)\) щоб реагувати з більшою частиною субстрату:

\[\ce{ES} \rightarrow \ce{P} + \ce{E}\]

Однак реакція між ферментом і субстратом часто протікає набагато складніше. У багатьох випадках субстрат стає ковалентно пов'язаним з ферментом. Потім на наступному етапі або етапах ферментно-зв'язаний субстрат\(\left( \ce{ES'} \right)\) реагує на отримання продуктів і регенерувати активний фермент\(\left( \ce{E} \right)\):

\[\ce{ES} \rightarrow \ce{ES'} \rightarrow \ce{P} + \ce{E}\]

Карбоксипептидаза А

Значна деталь, до якої ми зараз можемо зрозуміти ферментний каталіз, добре проілюстрована тим, що відомо про дію карбоксипептидази А. Цей фермент (розділ 25-7B і Таблиця 25-3) є одним з травних ферментів підшлункової залози, які конкретно гідролізують пептидні зв'язки на\(\ce{C}\) -кінцевий термінал. Відомі як амінокислотна послідовність, так і тривимірна структура карбоксипептидази А. Фермент являє собою єдиний ланцюжок з 307 амінокислотних залишків. Ланцюг має області, де вона асоціюється як\(\alpha\) спіраль та інші, де вона асоціюється як\(\beta\) плісировані аркуш. Протезна група являє собою іон цинку, пов'язаний з трьома специфічними амінокислотами і однією молекулою води біля поверхні молекули. Амінокислоти, пов'язані з цинком, є His 69, His 196 і Glu 72; нумерація відноситься до положення амінокислоти уздовж ланцюга, причому амінокислота на\(\ce{N}\) -terminus є номером 1. Іон цинку необхідний для активності ферменту і задіяний, отже, як частина активної ділянки.

Рентгенологічні дослідження\(^9\) карбоксипептидази, комплексної з гліцилтирозином (з яким він реагує лише повільно) дають детальний опис активної ділянки, яке схематично показано на малюнку 25-19а і пояснюється нижче.

Малюнок 25-19: Кроки в можливому механізмі дії карбоксипептидази. (а) Субстрат показаний комплексом до поверхні ферменту через\(\ce{X}\),\(\ce{Y}\)\(\ce{Z}\), і\(\ce{W}\);\(\ce{X}\) є неполярною кишенею;\(\ce{Y}\) є водневим зв'язком, можливо, з\(\ce{OH}\) Tyr 248;\(\ce{Z}\) є протезною групою\(\ce{Zn}\); і\(\ce{W}\) є іонною взаємодія\(\ce{=} \overset{\oplus}{\ce{N}} \ce{H_2}\) з Arg 145. \(\ce{C}\)-термінальний амідний зв'язок субстрату тримається близько до каталітичного майданчика, який є карбоксилом Glu 270. (б) Тетраедричний проміжний продукт може бути утворений атакою аніону карбоксилату Glu 270 на амід-карбоніл субстрату. (c) Розщеплення чотиригранного проміжного продукту (b) вивільняє\(\ce{C}\) -кінцеву амінокислоту і утворює проміжний ацил-фермент. (d) Залишок ланцюга субстрату звільняється від ферменту шляхом гідролізу проміжного ацил-ферменту. Ці малюнки дефіцитні тим, що вони намагаються відтворити тривимірну ситуацію в двох вимірах. Третій вимір особливо важливий в розумінні стереоспецифічності ферменту.

1. Тирозинкарбоксилатна група субстрату пов'язана електростатичним притяганням з позитивно зарядженою бічним ланцюгом аргініну 145\(\left( \ce{W} \right)\):

2. Бічний ланцюг тирозину субстрату асоціюється з неполярною кишенею в ферменті\(\left( \ce{X} \right)\).
3. Водень зв'язок можливо відбувається між субстратом тирозинаміду нерозділеної пари і\(\ce{HO}\) групами бічних ланцюгів ферменту тирозину 248\(\left( \ce{Y} \right)\).
4. Глицилкарбонільний кисень у субстраті, ймовірно, узгоджується з іоном цинку\(\left( \ce{Z} \right)\), витісняючи молекулу води, координовану з цинком у некомплексному ферменті.
5. Бічний ланцюг карбоксилатний аніон глутамінової кислоти 270 настільки розташований по відношенню до реакційного центру, що він цілком може функціонувати як нуклеофіл, атакуючи карбонільний вуглець гліцину.

Розташування ферментно-субстратного комплексу передбачає правдоподібний механізм реакції, аналогічний неферментативним механізмам гідролізу амідів (розділ 24-4). Карбоксильна група Glu 270 може додати до аміду карбонілу, щоб утворити чотиригранний проміжний продукт, який потім швидко дисоціює, щоб вивільнити кінцеву амінокислоту, залишаючи решту субстрату, пов'язану з ферментом, як змішаний ангідрид, який можна символізувати як\(\ce{E(CO)OCOR_1}\). Реакція проміжного ацил-ферменту з водою вивільнить пептид, мінус кінцеву амінокислоту, і регенерує фермент.

Ця постульована послідовність подій може залишити вас питанням, чому фермент прискорює гідроліз, тим більше, що послідовність протікає через енергетично несприятливу реакцію, утворення карбонового ангідриду з аміду і карбонової кислоти:

Малюнок 25-20 показаний з більш високим енергетичним перехідним станом, ніж з водою, як і слід було очікувати, тому що\(\ce{CH_3CO_2H}\) є біднішим нуклеофілом, ніж вода.

Малюнок 25-20: Можливі енергетичні профілі для різних шляхів гідролізу простого аміду. Пунктирна лінія являє собою каталізоване ферментом утворення\(\ce{R(CO)OCOCH_3}\), яке тут гіпотезується, щоб мати нижчий енергетичний перехідний стан, ніж реакція ангідриду з водою (див. Текст).

Як же тоді ми можемо очікувати, що фермент може зробити шлях ангідриду швидшим, ніж простий водний шлях? Відповіддю є спосіб, яким взаємодії в ферментно-субстратному комплексі можуть стабілізувати перехідний стан для ангідридоутворюючої реакції. Таким чином, для карбоксипептидази цинк може діяти як сильний електрофіл для полегшення нападу на карбоніл аміду. Водневе з'єднання амідного азоту з Tyr 248 полегшить атаку на карбонільну групу та сприятиме розриву\(\ce{C-N}\) зв'язку. Крім того, неполярне середовище алкільних бічних ланцюгів ферменту збільшить нуклеофільність\(\ce{-CO_2^-}\) групи, яка утворює ангідрид (див. Розділ 8-7F). Огляд малюнка 25-20 якісно показує, що якщо енергія перехідного стану для утворення ангідриду сильно знижена, то загальна швидкість буде визначатися швидкістю гідролізу ангідриду! У цій обставині (припускаючи, що гідроліз ангідриду не каталізується) ефективність ферменту в розриві пептидного зв'язку настільки велика, наскільки це може бути, принаймні, цим конкретним шляхом пептидного гідролізу. Такі показники ефективності були встановлені для інших ферментів.

Участь серину в дії ферменту

Механізми, подібні до описаного для карбоксипептидази, як видається, діють при гідролізі амідних і ефірних зв'язків, каталізованих рядом протеїназ і естераз. Субстрат, тут узагальнений як\(\ce{RCOX}\), діє на ациляцію ферменту, який згодом вступає в реакцію з водою, щоб дати спостережувані продукти:

На стадії ацилювання нуклеофільна група на одній з амінокислотних бічних ланцюгів на активній ділянці поводиться як нуклеофіл. Як ми бачили в розділі 25-9B, нуклеофіл карбоксипептидази - це вільна карбоксильна група глутамінової кислоти 270. У кількох інших ферментах (хімотрипсин, субтилізин, трипсин, еластаза, тромбін, ацетилхолінестераза) вона являє собою гідроксильну групу серінового залишку:

Звідси виникає інше питання. Чому серин гідроксил є ефективним нуклеофілом, коли вода та інші гідроксильні сполуки явно не настільки ж ефективні? Мабуть, нуклеофільність серину\(\ce{-CH_2OH}\) посилюється кислотно-лужним каталізом, що включає перенесення протонів між кислотними та основними функціями бічного ланцюга в безпосередній близькості від активного ділянки. Вважається, що серин переносить свій\(\ce{OH}\) протон в амфотерну\(^{10}\) ділянку\(\ce{B-A-H}\) на ферменті в той же момент, коли протон\(\ce{B-A-H}\) переноситься на іншу основу\(\ce{B'}^\ominus\) (рівняння 25-8). Ці протонні передачі, звичайно, оборотні:

\(\tag{25-8}\)

Втрата його протона робить серингідроксильний кисень набагато потужнішим нуклеофілом, і навіть незважаючи на те, що рівновага рівняння 25-8 повинна лежати далеко ліворуч при фізіологічному рН, це може значно збільшити реакційну здатність гідроксилу серину.

У хімотрипсину та субтилізину ця мережева система заряду-реле, як її називають, складається зі специфічного залишку аспарагінової кислоти, що діє як\(\ce{B'}^\ominus\), і специфічного залишку гістидину (що діє як амфотерний\(\ce{B-A-H}\)):

\(^7\)Повільність, з якою гідролізуються амідні зв'язки в присутності або сильних кислот, або сильних підстав, і їх схильність до гідролізу під впливом ферментів, однозначно є ключовою перевагою в біологічному функціонуванні пептидів. Амідний гідроліз в нейтральному розчині має сприятливу, але не велику постійну рівноваги. Тому не потрібно багато біохімічної енергії ні для формування, ні для гідролізу пептидних зв'язків. Стійкість до звичайного гідролізу забезпечує необхідну стабільність для білків, і все ж коли необхідно розщеплювати пептидні зв'язки білків, як і при травленні, це можна зробити плавно і ефективно за допомогою протеолітичних ферментів.

\(^8\)Багато ферменти називаються шляхом додавання суфікса -ази до слова, або слів, описових типу ферментативної активності. Так, естерази гідролізують складні ефіри, протеїнази гідролізують білки, редуктази досягають скорочень, а синтетази досягають синтезу поліпептидних ланцюгів, ланцюгів нуклеїнових кислот та інших молекул.

\(^9\)Ліпскомб, Рахунки хімічних досліджень 3, 81 (1970); Е.Т. Кайзер і Б.Л. Кайзер, там же 5, 219 (1972). Lipscomb отримав Нобелівську премію 1976 року з хімії за структурні роботи з боранів.

\(^{10}\)Амфотерний означає, що речовина може виступати або як кислота, або як основа.

Дописувачі та атрибуція

Template:ContribRoberts