7.8: Аналіз білка за допомогою мас-спектроскопії іонізації Electrospray
- Page ID
- 18563
Електроспрей іонізаційно-мас-спектрометрія (ESI-MS) - аналітичний метод, який фокусується на високомолекулярному структурному визначенні. Унікальним компонентом ESI-MS є іонізація електроспреєм. Розробка електророзпилення, процесу зарядки рідини в тонкий аерозоль, була завершена в 1960-х роках, коли Малкольм Доул (рис.\(\PageIndex{1}\)) продемонстрував здатність хімічних видів відокремлюватися за допомогою методів електророзпилення. З цим важливим поворотом подій комбінація ESI та MS була здійсненною і пізніше була розроблена Джоном Фенном (рис.\(\PageIndex{2}\)), як функціональний аналітичний метод, який міг би надати корисну інформацію про структуру та розмір білка. Фенн розділив Нобелівську премію в 2002 році з Коічі Танака (фігура\(\PageIndex{3}\) і Курт Вутріх (рис.\(\PageIndex{4}\)) для розробки ESI-MS.




ESI-MS - це процес, за допомогою якого білки, або макромолекули, в рідкій фазі заряджаються і фрагментуються на більш дрібні аерозольні краплі. Ці аерозольні краплі втрачають свій розчинник і просувають заряджені фрагменти в газову фазу в декількох компонентах, які змінюються в залежності від заряду. Ці компоненти потім можуть бути виявлені за допомогою мас-спектрометра. Недавній бум і розвиток ESI-MS пояснюється його перевагами в характеристиці та аналізі макромолекул, зокрема біологічно важливих макромолекул, таких як білки.
Як працює функція ESI-MS?
ESI-MS - це процес, який вимагає, щоб зразок знаходився в рідкому розчині, так що крихітні краплі можуть бути іонізовані та аналізовані окремо за допомогою мас-спектрометра. Нижче розмежовуються процеси, які відбуваються як релевантні для малюнка\(\PageIndex{5}\):
- Розпилювальна голка/капіляр- Рідкий розчин потрібної макромолекули вводять в систему через цю голку. Голка сильно заряджається через зовнішнє джерело напруги, яке підтримує постійну заряд по всій голці. Нормальний заряд для голки становить приблизно від 2,5 до 4 кВ. Напруга змушує великі краплі фрагментуватися на дрібні краплі на основі заряду, який накопичується з білкових складових частин, і рідина зараз знаходиться в газовій фазі.
- утворення крапель- Краплі, які виганяються з голки, менше, ніж спочатку, і в результаті розчинник випарується. Потім менші краплі починають збільшувати щільність заряду на поверхні, коли обсяг зменшується. Оскільки крапельки поблизу межі Релея, кулонівські взаємодії крапельки дорівнюють поверхневому натягу крапельки, виникає кулонівський вибух, який додатково розбиває краплю на дрібні фракції, включаючи ізольований аналіт із зарядом.
- Вакуумний інтерфейс/конус - Ця частина пристрою дозволяє краплям вирівнюватися в невеликому сліді і пройти до мас-спектрометра. Вирівнювання відбувається через схожість і відмінності зарядів серед всіх крапель. Всі краплі іонізуються до позитивних зарядів шляхом додавання протонів до різних основних ділянок на краплях, але всі заряди змінюються за величиною залежно від кількості основних ділянок, доступних для протонації. Приймальний кінець або конус має протилежний заряд розпилювальної голки, викликаючи тяжіння між конусом і краплями.
- Мас-спектрометр- Заряджені частинки потім досягають мас-спектрометра і відхиляються на основі заряду кожної частинки. Прогин відбувається квадрупольним магнітом мас-спектрометра. Різні шляхи відхилення іонів відбуваються через силу взаємодії з магнітним полем. Це призводить до різних шляхів, заснованих на співвідношенні маса/заряд (м/з). Потім частинки зчитуються іонним детектором, коли вони надходять, забезпечуючи спектр на основі співвідношення m/z.

Які дані надаються ESI-MS?
Як випливає з назви, дані, отримані з цієї методики, є мас-спектрометрічним спектром. Не заглиблюючись занадто глибоко в тему мас-спектрометрії, яка виходить за межі справжнього обсягу цього модуля, тут буде надано невелике пояснення. Мас-спектрометр відокремлює частинки на основі магнітного поля, створеного квадрупольним магнітом. Сила взаємодії змінюється від заряду, який несуть частинки. Величина відхилення або сила взаємодії визначається іонним детектором і кількісно визначається в співвідношенні маса/заряд (м/з). Через цю інформацію можна легко керувати визначенням хімічного складу або пептидної структури, як це пояснюється більш детально в наступному розділі.
Інтерпретація типового спектру MS
Інтерпретація даних мас-спектрометрії передбачає розуміння співвідношення m/z. Знання, необхідні для розуміння інтерпретації спектра, полягає в тому, що піки відповідають частинам цілої молекули. Тобто гіпотетично, якщо поставити людське тіло в мас-спектрометр, один пік збігається з однією рукою, інший пік збігається з рукою і животом і т.д. загальна ідея за цими піками полягає в тому, що накладення буде малювати всю картину, або у випадку гіпотетичного прикладу, забезпечують зображення людського тіла. Співвідношення m/z визначає ці порції на основі зарядів, що переносяться ними; таким чином, термінологія співвідношення маса/заряд. Чим більше зарядів містить частина макромолекули або білка, тим меншим буде співвідношення m/z і чим далі він з'явиться на спектрі. Фундаментальна концепція інтерпретації передбачає розуміння того, що піки взаємопов'язані, і, таким чином, математичні розрахунки можуть бути проведені для надання відповідної інформації про аналізуваний білок або макромолекулу.
Розрахунки m/z піків спектра МС
Як згадувалося вище, відповідна інформація, яка повинна бути отримана з даних ESI-MS, екстраполюється з розуміння того, що піки взаємопов'язані. Етапи розрахунку даних наступні:
- Визначте, які дві сусідні піки будуть аналізуватися.
- Встановіть перший пік (найдальший лівий) як пік з найбільшим співвідношенням m/z. Це математично визначається як наш пік z +1.
- Встановіть сусідній пік праворуч від нашого першого піку як пік з нижнім співвідношенням m/z. Це математично наш z пік.
- Наш пік z +1 також буде нашим піком m +1, оскільки різниця між двома піками - це заряд одного протона. Отже, наш пік z буде визначатися як наш m пік.
- Розв'яжіть обидва рівняння для m, щоб забезпечити підстановку. Обидві сторони рівняння повинні бути через z і можуть бути розв'язані.
- Визначте заряд піку z і згодом, заряд піку z+1.
- Відніміть один із співвідношення m/z і помножте співвідношення m/z кожного піку на попередні заряди, визначені для отримання маси білка або макромолекули.
- Усередніть результати для визначення середньої маси макромолекули або білка.
1. Визначте, які дві сусідні піки будуть аналізуватися з МС (рис.\(\PageIndex{6}\)) як m/z = 5 і m/z = 10 піків.

2. Встановіть перший пік (найдальший лівий на малюнку,\(\PageIndex{1}\) як пік z + 1 (тобто z + 1 = 5).
3. Встановіть сусідній пік праворуч від першого піку як пік z (тобто z = 10).
4. Встановіть пікові коефіцієнти,\ ref {1} і\ ref {2}.
\[ \frac{m+1}{z+1} =\ 5 \label{1} \]
\[ \frac{m}{z} = 10 \label{2} \]
5. Розв'яжіть співвідношення для m:\ ref {3} і\ ref {4}.
\[ m\ =\ 5z\ +\ 4 \label{3} \]
\[ m\ =\ 10z \label{4} \]
6. Замініть одне рівняння для m:\ ref {5}.
\[ 5z\ +\ 4\ =\ 10z \label{5} \]
7. Вирішити для z:\ ref {6}.
\[ z\ = 4/5 \label{6} \]
8. Знайти z+1:\ ref {7}.
\[ z\ +\ 1\ =\ 9/5 \label{7} \]
Знайти середню молекулярну масу, віднімаючи масу на 1 і помноживши на заряд:\ ref {8} і\ ref {9}. Значить, середня маса = 7,2
\[ (10\ -\ 1)(4/5)\ =\ 7.2 \label{8} \]
\[ (5\ -\ 1)(9/5)\ =\ 7.2 \label{9} \]
Підготовка зразків
Зразки для ЕСІ-МС повинні знаходитися в рідкому стані. Ця вимога забезпечує необхідне середовище, щоб легко зарядити макромолекули або білки в тонкий аерозольний стан, який можна легко фрагментувати, щоб забезпечити бажані результати. Перевага цієї методики полягає в тому, що тверді білки, які колись було важко аналізувати, як металотіонеїн, можуть розчинятися у відповідному розчиннику, який дозволить проводити аналіз через ESI-MS. Оскільки зразок доставляється в систему у вигляді рідини, капіляр може легко зарядити розчин, щоб почати фрагментацію білка на більш дрібні фракції. Максимальний заряд капіляра становить приблизно 4 кВ. Однак така кількість заряду потрібно не для кожної макромолекули. Відповідний заряд залежить від розміру і характеристики розчинника і кожної окремої макромолекули. Це дозволило зняти межу молекулярної маси, яка колись була вірною для простого мас-спектрометрічного аналізу білків. Великі білки та макромолекули тепер можна легко виявити та проаналізувати за допомогою ESI-MS завдяки об'єкту, за допомогою якого молекули можуть фрагментуватися.
Супутні методи
Пов'язана методика, яка була розроблена приблизно в той же час, що і ESI-MS, - матрична лазерна десорбція/іонізаційна мас-спектрометрія (MALDI-MS). Ця методика, яка була розроблена наприкінці 1980-х років як свердловини, служить тій же фундаментальній меті; дозволяючи аналізувати великі макромолекули за допомогою мас-спектрометрії через альтернативний шлях генерації необхідної газової фази для аналізу. У MALDI-MS матриця, як правило, складається з кристалізованої 3,5-диметокси-4-гідроксикоричної кислоти (рис.\(\PageIndex{7}\)), води та органічного розчинника, використовується для змішування аналіту, а для зарядки матриці використовується лазер.

Потім матриця спільно кристалізує аналіт, а імпульси лазера потім використовуються, щоб викликати десорбцію матриці та деяких кристалів аналіту з нею, що призводить до іонізації кристалів і зміни фази в газоподібний стан. Потім аналіти зчитуються тандемним мас-спектрометром. Таблиця\(\PageIndex{1}\) безпосередньо порівнює деякі атрибути між ESI-MS і MALDI-MS. Слід зазначити, що існує кілька варіацій як ESI-MS, так і MALDI-MS, при цьому методи збору даних змінюються та підкладка декількох інших методів (рідинна хроматографія, капілярний електрофорез, індуктивно зв'язана плазмова мас-спектрометрія тощо), але всі вони мають однакове фундаментальні принципи як ці основні два методи.
Експериментальні деталі | ЕСІ-МС | МАЛЬДІ-МС |
---|---|---|
Стартовий стан аналітики | Рідина | Рідина/тверда речовина |
метод іонізації | Заряджена капілярна голка | Матрична лазерна десорбція |
Кінцевий стан аналізу | Газ | Газ |
Необхідна кількість білка | 1 мкл | 1 мкл |
метод спектра | Мас-спектрометрія | Мас-спектрометрія |
Проблеми з ESI-MS
ESI-MS виявився корисним при визначенні третинної структури та обчислень молекулярної маси великих макромолекул. Однак існує ще кілька проблем, включених у техніку та аналіз макромолекул. Однією з проблем є виділення потрібного білка для аналізу. Якщо білок не може бути витягнутий з клітини, це зазвичай робиться за допомогою гелевого електрофорезу, є обмежуючий фактор в тому, що білки можна проаналізувати. Цитохром с (рис.\(\PageIndex{7}\)) - приклад білка, який можна виділити і проаналізувати, але дає цікаве обмеження на те, як аналітична методика не функціонує для повністю ефективного аналізу білка. Проблема з цитохромом с полягає в тому, що навіть якщо білок знаходиться в своєму рідному підтвердженні, він все одно може показувати різний розподіл заряду. Це відбувається через наявність основних ділянок для протонації, які послідовно піддаються впливу розчинника. Будь-яка незначна зміна нативної конформації може призвести до блокування основних сайтів, таких як цитохром с, що призводить до того, що можна побачити різні співвідношення m/z. Ще одне цікаве обмеження спостерігається, коли неорганічні елементи, такі як протеїни металотіонеїнів, які містять цинк, аналізуються за допомогою ESI-MS. Металотіонеїни мають кілька ізоформ, які не показують послідовної тенденції в даних ESI-MS між різноманітними ізоформами. Помічені відмінності виникають через те, що металізація кожної ізоформи відрізняється, що призводить до того, що електророзпилення і, як наслідок, протонування білка відрізнятися. Таким чином, включення атомів металів у білки може мати різний вплив на дані ESI-MS через несподівану взаємодію між металевим центром і самим білком.
