3.6: Капілярний електрофорез
- Page ID
- 18790
Капілярний електрофорез (СЕ) охоплює сімейство електрокінетичних методів поділу, які використовують прикладне електричне поле для відокремлення аналітів на основі їх заряду та розміру. Основний принцип залежить від електрофорезу, який являє собою рух частинок щодо рідини (електроліту) під впливом електричного поля. Батько-засновник електрофорезу, Арне В.К. Тізеліус (рис.\(\PageIndex{1} a \)), вперше використовував електрофорез для відокремлення білків, і він продовжив, щоб отримати Нобелівську премію з хімії в 1948 році за свою роботу як з електрофорезу, так і адсорбційного аналізу. Однак саме Стеллан Хьєртен (Рисунок\(\PageIndex{1} b\)) працював під керівництвом Арне В.К. Тізеліуса, який став піонером роботи в CE в 1967 році, хоча CE не був добре визнаний до 1980 року, коли Джеймс У. Йоргенсон (рис.\(\PageIndex{1} c \)) і Крінн Д. Лукач опублікували серію робіт, що описують цю нову техніку.
Огляд приладу
Основні складові СЕ показані на малюнку\(\PageIndex{2}\). Електричний ланцюг СЕ є серцем приладу.
Методи ін'єкцій
Зразки, які вивчаються в CE, - це переважно рідкі зразки. Типова капілярна колонка має внутрішній діаметр 50 мкм і довжину 25 см. Оскільки стовпець може містити лише мінімальну кількість запущеного буфера, можна перевірити лише невеликі обсяги вибірки (nL до мкл). Зразки вводяться в основному двома методами ін'єкцій: гідродинамічним і електрокінетичним інжекцією. Два методи відображені в таблиці\(\PageIndex{1}\) Недоліком електрокінетичної ін'єкції є те, що склад введеного зразка може бути не таким, як склад вихідного зразка. Це пояснюється тим, що метод ін'єкції залежить від електрофоретичної та електроосмотичної рухливості виду у зразку. Однак обидва способи ін'єкції залежать від температури і в'язкості розчину. Отже, важливо контролювати обидва параметри, коли бажаний відтворюваний обсяг ін'єкцій зразка. При проведенні кількісного аналізу на зразках доцільно використовувати внутрішні стандарти замість зовнішніх стандартів, оскільки важко контролювати як температуру, так і в'язкість розчину.
| Методи ін'єкцій | Принцип роботи |
|---|---|
| Гідродинамічне впорскування | Флакон для зразків укладено в камеру з зануреним в неї одним кінцем нерухомої капілярної колони. Потім тиск подається на камеру протягом фіксованого періоду, щоб зразок міг потрапити в капіляр. Після того, як зразок був введений, капіляр вилучається, а потім знову занурюється в вихідний резервуар і відбувається поділ. |
| Електрокінетична ін'єкція | Зразок укладено в камеру з зануреним в неї одним кінцем капілярної колони з присутнім електродом. Електричне поле прикладається, і зразки потрапляють в капіляр. Після того, як зразок був введений, капіляр вилучається, а потім знову занурюється в вихідний резервуар і відбувається поділ. |
Колонка
Після введення зразків капілярна колонка використовується як основне середовище для відділення компонентів. Капілярна колонка, що використовується в CE, має ті ж характеристики, що і капілярна колонка, що використовується в газовій хроматографії (ГК); однак найбільш критичними компонентами колонки CE є:
- внутрішній діаметр капіляра,
- загальна довжина капіляра,
- довжина колонки від інжектора до детектора.
Буфер розчинника
Буфер розчинника переносить зразок через колонку. Дуже важливо використовувати хороший буфер, оскільки успішний експеримент CE залежить від цього. CE заснований на поділі зарядів в електричному полі. Тому буфер повинен або підтримувати існуючий заряд на аналіті, або дозволяти аналіту отримати заряд, і важливо враховувати рН буфера перед його використанням.
Прикладна напруга (кВ)
Прикладена напруга має важливе значення при поділі аналітів, оскільки воно керує рухом аналіту. Важливо, щоб він не був занадто високим, оскільки це може стати проблемою безпеки.
Детектори
Аналіти, які були відокремлені після подачі напруги, можуть бути виявлені багатьма методами виявлення. Найпоширенішим методом є УФ-видиме поглинання. Виявлення відбувається через капіляр, при цьому невелика частина капіляра виступає в якості детективної клітини. Комірка виявлення на трубці зазвичай робиться оптично прозорою шляхом зішкрібання поліімідного покриття та покриття його іншим оптично прозорим матеріалом, щоб капіляр не зламався легко. Для видів, які не мають хромофора, в буферний розчин можна додати хромофор. Коли аналіт проходить повз, відбудеться зменшення сигналу. Цей зменшений сигнал буде відповідати кількості присутнього аналіту. Інші поширені методи виявлення, які можна використовувати в CE, є флуоресценція і мас-спектрометрія (MS).
Теорія
У СЕ зразок вводять в капіляр вищевказаними способами. Потім застосовується висока напруга, в результаті чого іони зразка мігрують до електрода в резервуарі призначення, в даному випадку катода. Міграція та розділення компонентів зразка визначаються двома факторами: електрофоретичною рухливістю та електроосмотичною рухливістю.
Електрофоретична рухливість
Електрофоретична рухливість за своєю суттю залежить від властивостей розчиненої речовини та середовища, в якому рухається розчинена речовина.\(μ_{ep}\) По суті, це постійне значення, яке можна обчислити, як задано\ ref {1}, де\(q\) заряд розчину,\(η\) є буферною в'язкістю і\(r\) радіусом розчиненої речовини.
\[ \mu _{ep} = \dfrac{q}{6\pi \eta r} \label{1} \]
Електрофоретична швидкість,\(v_{ep}\), залежить від електрофоретичної рухливості і прикладеного електричного поля,\(E\) (\ ref {2}).
\[ \nu _{ep} = \mu _{ep} E \label{2} \]
Таким чином, коли розчинені речовини мають більше відношення заряду до розміру, електрофоретична рухливість і швидкість зростуть. Катіони та аніон рухатимуться в протилежних напрямках, що відповідають ознаці електрофоретичної рухливості з є результатом їх заряду. Таким чином, нейтральні види, які не мають заряду, не володіють електрофоретичної рухливістю.
Електроосмотична мобільність
Другим фактором, який контролює міграцію розчиненої речовини, є електроосмотичний потік. При нульовому заряді очікується, що нейтральний вид повинен залишатися нерухомим. Однак у звичайних умовах буферний розчин також рухається до катода. Причиною електроосмотичного потоку є електричний подвійний шар, який розвивається на межі розділу розчину кремнезему.
При рН більше 3 рясні силанольні (-ОН) групи, присутні на внутрішній поверхні кремнеземного капіляра, депротонують з утворенням негативно заряджених іонів силанату (-SiO -). Катіони, присутні в буферному розчині, будуть притягуватися до іонів силанату, і деякі з них будуть міцно зв'язуватися з ним, утворюючи нерухомий шар. Освіта нерухомого шару лише частково нейтралізує негативний заряд на стінках капілярів. Значить, в шарі, прилеглому до нерухомого шару, буде присутній більше катіонів, ніж аніонів, утворюючи дифузний шар. Поєднання фіксованого шару та дифузного шару відоме як подвійний шар, як показано на малюнку\(\PageIndex{3}\). Катіони, присутні в дифузному шарі, будуть мігрувати до катода, оскільки ці катіони розчиняються, розчин також буде текти разом з ним, створюючи електроосмотичний потік. Аніони, присутні в дифузному шарі, розчиняються і будуть рухатися до анода. Однак, оскільки катіонів більше, ніж аніонів, катіони будуть штовхати аніони разом з ним у напрямку катода. Значить, електроосмотичний потік рухається в напрямку катода.
Електроосмотична рухливість, μ eof, описується\ ref {3}, де - дзета-потенціал, ε - буферна діелектрична проникність і η - буферна в'язкість. Електроосмотична швидкість, v eof, - швидкість, з якою буфер рухається через капіляр, задається\ ref {4}.
\[ \mu _{eof} \ =\ \frac{\zeta \varepsilon }{4\pi \eta } \label{3} \]
\[ \nu _{eof}\ =\ \mu _{eof}E \label{4} \]
Zeta Потенціал
Дзета-потенціал,, також відомий як електрокінетичний потенціал - це електричний потенціал на межі розділу подвійного шару. Значить, в нашому випадку, це потенціал дифузного шару, який знаходиться на кінцевій відстані від капілярної стінки. Зета-потенціал в основному впливає і прямо пропорційний двом факторам:
- Товщина подвійного шару. Більш висока концентрація катіонів, можливо, через збільшення іонної міцності буфера призведе до зменшення товщини подвійного шару. Зі зменшенням товщини подвійного шару дзета-потенціал зменшуватиметься, що призводить до зменшення електроосмотичного потоку.
- Заряд на стінках капілярів. Більша щільність іонів силанату відповідає більшому дзета-потенціалу. Освіта іонів силанату залежить від рН. Отже, при рН менше 2 спостерігається зменшення дзета-потенціалу та електроосмотичного потоку, оскільки силанол існує в протонованому вигляді. Однак зі збільшенням рН утворюється більше іонів силанатів, що спричиняє збільшення дзета-потенціалу і, отже, електроосмотичного потоку.
орден елюції
Електроосмотичний потік буфера, як правило, більший, ніж електрофоретичний потік аналітів. Отже, навіть аніони рухатимуться до катода, як показано на малюнку\(\PageIndex{4}\). Невеликі, сильно заряджені катіони будуть першими, хто елітує перед більшими катіонами з меншим зарядом. Далі слідують нейтральні види, які елюються як одна смуга посередині. Більші аніони з низьким рівнем заряду елют далі і, нарешті, сильно заряджений малий аніон матиме найдовший час елюації. Це наочно зображено на електроферограмі на рис\(\PageIndex{5}\).
Оптимізація експерименту CE
Існує кілька компонентів, які можна варіювати для оптимізації електроферограми, отриманої з СЕ. Отже, для будь-якої заданої настройки повинні бути відомі певні параметри:
- загальна довжина капіляра (L),
- довжина руху розчинених речовин від початку до детектора (л),
- прикладена напруга (В).
Скорочення часу міграції, млн
Щоб скоротити час аналізу, можна використовувати більш високу напругу або використовувати більш коротку капілярну трубку. Однак важливо відзначити, що напруга не може бути довільно високим, оскільки це призведе до нагрівання джоуля. Іншою можливістю є збільшення μ eof за рахунок збільшення рН або зменшення іонної сили буфера,\ ref {5}.
\[ t_{mn} \ =\ \frac{1\ L}{(\mu _{ep} \ +\ \mu_{eof}) V } \label{5} \]
Ефективність
У хроматографії ефективність задається кількістю теоретичних пластин, N. У CE існує аналогічний параметр,\ ref {6} де D - коефіцієнт дифузії розчину. Підвищення ефективності s зі збільшенням напруги, що застосовується, оскільки розчинена речовина витрачає менше часу в капілярі, буде менше часу для розсіювання розчиненої речовини. Як правило, для CE N буде дуже великим.
\[ N\ =\frac{1^{2}}{2Dt_{mn}} = \frac{\mu _{tot} V l}{2DL} \label{6} \]
Роздільна здатність між двома піками
Роздільна здатність між двома піками, R, визначається\ ref {7}, де Δv - різниця у швидкості двох розчинених речовин, а - середня швидкість двох розчинених речовин.
\[ R= \frac{\sqrt{N} }{4} \times \frac{\Delta v}{ \tilde{\nu } } \label{7} \]
Підстановка рівняння на N дає\ ref {8}
\[ R\ = 0.177(\mu _{ep,1} \ -\ \mu _{ep,2}) \sqrt{ \frac{V}{D(\nu _{av} + \mu _{eof})} } \label{8} \]
Тому збільшення прикладеної напруги, В, збільшить дозвіл. Однак це не дуже ефективно, оскільки 4-кратне збільшення прикладеної напруги дасть лише 2-кратне збільшення роздільної здатності. Крім того, збільшення N, кількість теоретичних пластин призведе до кращої роздільної здатності.
Вибірковість
У хроматографії селективність α визначається як співвідношення двох факторів утримання розчиненої речовини. Це те саме для CE,\ ref {9}, де t 2 та t 1 - час утримання двох розчинених речовин таким чином, що α більше 1.
\[ \alpha =\frac{t_{2}}{t_{1}} \label{9} \]
Вибірковість можна поліпшити, регулюючи рН буферного розчину. Мета полягає в зміні заряду елююваного виду.
Порівняння між CE та ВЕРХ
CE на відміну від високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) вміщує багато зразків і має тенденцію мати кращу роздільну здатність та ефективність. Порівняння двох методів наведено в табл\(\PageIndex{2}\).
| CE | ВЕРХ |
|---|---|
| Більш широкий вибір аналіту для аналізу | Обмежений розчинністю зразка |
| Більш висока ефективність, відсутність стаціонарного терміну масопередачі, оскільки немає стаціонарної фази | ККД знижується за рахунок стаціонарного терміну масопереносу (рівновага між стаціонарною та рухомою фазою) |
| Профіль електроосмотичного потоку в капілярі плоский, внаслідок чого не розширюється смуга. Краща пікова роздільна здатність та чіткіші піки | Закруглений ламінарний профіль потоку, який поширений у системах, що приводяться під тиском, таких як ВЕРХ. В результаті з'являються більш широкі піки та нижча роздільна здатність |
| Може бути з'єднаний з більшістю детекторів залежно від застосування | Деякі детектори вимагають зміни розчинника та попередньої модифікації зразка перед аналізом |
| Більша пікова ємність, оскільки використовує дуже велику кількість теоретичних пластин, N | Пікова ємність знижується, оскільки N не така велика |
| Високі напруги використовуються при проведенні експерименту | Немає необхідності в високій напрузі |
Міцелярна електрокінетична хроматографія
CE дозволяє розділяти заряджені частинки, і це в основному порівнюється з іонною хроматографією. Однак ніякого поділу для нейтральних видів в CE не відбувається. Таким чином, модифікована методика СЕ під назвою міцелярна електрокінетична хроматографія (MEKC) може бути використана для поділу нейтралів залежно від його розміру та спорідненості до міцелли. У МЕКК види поверхнево-активних речовин додають в буферний розчин в концентрації, при якій будуть утворюватися міцели. Прикладом поверхнево-активної речовини є додецилсульфат натрію (SDS), як показано на малюнку\(\PageIndex{6}\)
Нейтральні молекули знаходяться в динамічній рівновазі між об'ємним розчином і внутрішньою частиною міцели. За відсутності міцели нейтральний вид досяг би детектора при t 0, але в присутності міцели він досягає детектора на t mc, де t mc більше t 0. Чим довше нейтральна молекула залишається в міцеллі, тим довший час міграції. Таким чином, невеликі неполярні нейтральні види, які сприяють взаємодії з внутрішньою частиною міцели, займуть більше часу, щоб дістатися до детектора, ніж великим полярним видам. Аніонні, катіонні та цвіттеріонні поверхнево-активні речовини можуть бути додані для зміни коефіцієнта розподілу нейтральних видів. Катіонні поверхнево-активні речовини призведуть до отримання позитивних міцел, які рухатимуться у напрямку електроосмотичного потоку. Це дозволяє йому швидше рухатися до катода. Однак через швидку міграцію не виключено, що нейтральним видам приділяється недостатньо часу для взаємодії з міцеллою, що призводить до поганого поділу. Таким чином, всі фактори повинні бути враховані перед тим, як правильно вибрати ПАР для використання. Механізм поділу МЕКК і рідинної хроматографії однаковий. Обидва залежать від коефіцієнта поділу виду між рухомою фазою і стаціонарною фазою. Основна відмінність полягає в псевдостаціонарній фазі в MEKC, міцелах. Міцела, яку можна вважати стаціонарною фазою в MEKC, рухається з повільнішою швидкістю, ніж рухливі іони.
Квантові точки (QD) - це напівпровідникові нанокристали, які лежать в розмірному діапазоні 1-10 нм, і вони мають різну електрофоретичну рухливість завдяки різним розмірам і поверхневому заряду. CE може бути використаний для відокремлення та характеристики таких видів, а також розроблено метод характеристики та відокремлення CdSe QD у водному середовищі. QD синтезували із зовнішнім шаром триоктилфосфіну (TOP, рис.\(\PageIndex{7} a\)) та триоктилфосфіну оксиду (TOPO, рис.\(\PageIndex{7} b\)), що робить поверхню QD гідрофобною. Фоновий розчин електроліту використовувався SDS, щоб зробити QD розчинними у воді та сформувати комплекс QD-TOPO/TOP-SDS. Використовувалися різні розміри CdSe і поділ відбувався щодо співвідношення заряду до маси комплексів. З дослідження було зроблено висновок, що чим більше ядро CdSe (тобто, тим більше відношення заряду до маси) вилучається останнім. Електроферограма з дослідження показана на малюнку,\(\PageIndex{8}\) з якого видно, що хороше відділення відбулося за допомогою СЕ. Було використано лазерно-індуковане виявлення флуоресценції, буферна система була SDS, а рН встановленої системи був зафіксований на рівні 6,5. РН дуже важливий в даному випадку, оскільки стабільність системи і поділ залежать від нього.
