3.4: Надкритична рідинна хроматографія

Last updated
Save as PDF

Page ID: 18776

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Популярний і потужний інструмент у хімічному світі, хроматографія відокремлює суміші, засновані на хімічних властивостях - навіть деякі, ніж раніше вважалися нероздільними. Він поєднує в собі безліч частин, концепцій та хімічних речовин, щоб сформувати інструмент, придатний для конкретного поділу. Однією з форм хроматографії, яку часто не помічають, є надкритична рідинна хроматографія.

Історія

Надкритична рідинна хроматографія (SFC) починає свою історію в 1962 році під назвою «газова хроматографія високого тиску». Вона почалася повільно і була швидко затьмарена розвитком високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) та вже розробленої газової хроматографії. SFC не був популярним методом хроматографії до кінця 1980-х років, коли все більше публікацій почали ілюструвати його використання та методи.

SFC вперше повідомили Klesper et al. Їм вдалося розділити термічно лабільні порфіринові суміші на стаціонарній фазі поліетиленгліколю двома рухомими фазовими одиницями: дихлордифторметан (CcL ₂ _{F 2}) і монохлордифторметан (ChCl ₂ F), як показано на рис\(\PageIndex{1}\). Їх результати довели, що надкритичні рідини з низькою в'язкістю, але високою дифузійністю функціонують як рухома фаза.

Малюнок\(\PageIndex{1}\) Термічно лабільні порфірини (а) нікель етіопорфірін II і (б) нікель мезопорфірин IX.

Після роботи Клеспера детально описує його процедуру поділу, наступні вчені прагнули знайти ідеальну мобільну фазу та можливі варіанти використання SFC. Використовуючи такі гази, як He, N ₂_{, CO 2} та NH ₃, вони досліджували пурини, нуклеотиди, стероїди, цукру, терпени, амінокислоти, білки та багато інших речовин для їх утримання. Вони виявили, що СО ₂ є ідеальною надкритичною рідиною завдяки низькій критичній температурі 31° C і відносно низькому критичному тиску 72,8 атм. Додаткові переваги CO ₂ включали, що він дешевий, негорючий та нетоксичний. CO ₂ тепер є стандартною мобільною фазою для SFC.

При розробці SFC протягом багатьох років методика пройшла кілька фаз випробувань і помилок. Відкрита трубчаста капілярна колонка SFC мала перевагу самостійної та спільної зміни всіх трьох параметрів (тиск, температура та вміст модифікатора) певною мірою. Як і будь-який метод хроматографії, однак, він мав свої недоліки. Зміна тиску, найважливішого параметра, часто вимагала зміни швидкості потоку через постійний діаметр капілярів. Крім того, CO ₂, ідеальна рухлива фаза, є неполярною, і його полярність не може бути змінена легко або з градієнтом.

Протягом багатьох років було виявлено багато застосувань SFC. Він був ідентифікований як корисний засіб при поділі хіральних сполук, лікарських засобів, натуральних продуктів і органометаліків (докладніше див. Нижче). Більшість SFC в даний час беруть участь кремнезем (або кремнезем + модифікатор), упакованої колоною з рухомою фазою CO ₂ _{(або CO 2} + модифікатор). Мас-спектрометрія є найбільш поширеним інструментом, який використовується для аналізу відокремлених зразків.

Надкритичні рідини

Що таке надкритична рідина?

Як вже говорилося раніше, перевагою перед надкритичними рідинами є поєднання корисних властивостей з двох фаз: рідин і газів. Надкритичні рідини є газоподібними способами розширення для заповнення заданого об'єму, а рухи частинок близькі до руху газу. Що стосується властивостей рідини, надкритичні рідини мають щільність поблизу щільності рідин і, таким чином, розчиняються та взаємодіють з іншими частинками, як і слід було очікувати від рідини. Для візуалізації фазових змін по відношенню до тиску і температури використовуються фазові діаграми, як показано на малюнку.\(\PageIndex{2}\)

Малюнок\(\PageIndex{2}\) A Загальна діаграма стану (з відповідними точками, позначені).

\(\PageIndex{2}\)На малюнку показані різкі відмінності між двома фазами по відношенню до навколишніх умов. Існують два неоднозначні регіони. Однією з них є точка, в якій перетинаються всі три лінії: потрійна точка. Це температура і тиск, при яких всі три стани можуть існувати в динамічній рівновазі. Другий неоднозначний момент настає в кінці лінії рідина/газ, де вона якраз і закінчується. При цій температурі і тиску чиста речовина досягла точки, коли вона більше не буде існувати як одна або інша фаза: вона існує як гібридна фаза - динамічна рівновага рідини і газу.

Унікальні властивості надкритичних рідин

В результаті динамічної рівноваги рідина-газ надкритичні рідини володіють трьома унікальними якостями: підвищеною щільністю (за шкалою рідини), підвищеною дифузійністю (подібною до газу) і зниженою в'язкістю (за шкалою газу). Таблиця\(\PageIndex{1}\) показує подібності в кожному з цих властивостей. Пам'ятайте, кожне з них пояснює частину того, чому SFC є вигідним методом хімічного поділу.

Таблиця\(\PageIndex{1}\): Типові властивості газу, рідини і надкритичної рідини типових органічних сполук (на порядок).
	Щільність (г/мл)	Дифузійність (см2/с)	Динамічна в'язкість (г/см с)
Газ	1 х 10 ^-3	1 х 10 ^-1	1 х 10 ^-2
Рідина	1.0	5 х 10 ^-6	1 х 10 ^-4
Надкритична рідина	3 х 10 ^-1	1 х 10 ^-3	1 х 10 ^-2

Застосування властивостей надкритичних рідин до хроматографії

Чим корисні ці властивості? Ідеальна рухлива фаза і розчинник добре зроблять три речі: взаємодіяти з іншими частинками, переносити зразок через колону і швидко (але точно) елітувати його.

Щільність, як поняття, проста: чим щільніше щось, тим більша ймовірність того, що воно буде взаємодіяти з частинками, через які рухається. Уражена підвищенням тиску (з огляду на постійну температуру), на щільність багато в чому впливає речовина, що надходить в зону надкритичної рідини. Надкритичні рідини характеризуються щільністю, порівнянною з щільністю рідин, тобто вони мають кращий розчиняючий ефект і діють як кращий газ-носій. Висока щільність серед надкритичних рідин є обов'язковою як для їх дії як розчинників, так і для їх дії як газів-носіїв.

Дифузійність відноситься до того, як швидко речовина може поширюватися серед обсягу. При підвищеному тиску настає знижена дифузійність (зворотна залежність), але при підвищенні температури настає підвищена дифузійність (пряма залежність, пов'язана з їх кінетичною енергією). Оскільки надкритичні рідини мають значення дифузії між газом і рідиною, вони несуть перевагу щільності рідини, але дифузійність ближче до газу. Завдяки цьому вони можуть швидко переносити та елітувати зразок, роблячи ефективну рухливу фазу.

Нарешті, динамічну в'язкість можна розглядати як стійкість до інших компонентів, що протікають через або інтеркалізуються самі, в надкритичній рідині. На динамічну в'язкість навряд чи впливають температура або тиск для рідин, тоді як на неї можуть сильно вплинути надкритичні рідини. Завдяки здатності змінювати динамічну в'язкість через температуру та тиск, оператор може визначити, наскільки стійкою повинна бути їх надкритична рідина.

Надкритичні властивості СО ₂

Через його широке використання в SFC важливо обговорити, що робить CO ₂ ідеальною надкритичною рідиною. Одне з найбільших обмежень для більшості мобільних фаз в SFC - це змусити їх досягти критичної точки. Це означає надзвичайно високі температури та тиск, які нелегко досягти. Кращі гази для цього - ті, які можуть досягти критичної точки при відносно низьких температурах і тиску.

Як видно з малюнка\(\PageIndex{3}\), СО ₂ має критичну температуру приблизно 31° C і критичний тиск близько 73 атм. Це обидва відносно низькі числа і, таким чином, ідеально підходять для SFC. Звичайно, з кожним роком є і зворотна сторона. У цьому випадку СО ₂ не вистачає полярності, що ускладнює використання його рухомих фазових властивостей для елюції полярних зразків. Це легко фіксується модифікатором, про який і піде мова далі.

Малюнок\(\PageIndex{3}\) Фазова діаграма СО ₂

_{Інструмент}

SFC має подібну установку приладу до більшості інших машин для хроматографії, зокрема ВЕРХ. Функції деталей дуже схожі, але важливо розуміти їх з метою розуміння техніки. \(\PageIndex{4}\)На малюнку зображено схематичне зображення типового апарату.

Малюнок Діаграма\(\PageIndex{4}\) коробки машини SFC.

Колони

Існує два основних типи колон, що використовуються з SFC: відкриті трубчасті і упаковані, як показано нижче. Самі колони знаходяться поблизу ідентичні колонкам ВЕРХ за матеріалом і покриттями. Відкриті трубчасті колони найбільш використовуються і покриті зшитим кремнеземовим матеріалом (порошкоподібний кварц, SiO ₂) для стаціонарної фази. Довжини стовпців коливаються, але зазвичай падають від 10 до 20 метрів і покриті менш ніж 1 мкм діоксиду кремнезему стаціонарної фази. Малюнок\(\PageIndex{5}\) демонструє відмінності в упаковці двох колонок.

Рисунок\(\PageIndex{5}\) Схематична візуалізація різниці між (а) відкритою трубчастою і (б) упакованою колоною.

Інжектор

Форсунки виступають в якості основного майданчика для вставки зразків. Існує багато різних видів форсунок, які залежать від безлічі факторів. Для упакованих колон зразок повинен бути невеликим і точна кількість залежить від діаметра колони. Для відкритих трубчастих колон можна використовувати більші обсяги. В обох випадках існують специфічні форсунки, які використовуються в залежності від того, як зразок потрібно помістити в прилад. Контурний інжектор використовується в основному для попередніх випробувань. Зразок подається в камеру, яку потім промивають надкритичною рідиною і штовхають вниз по колоні. Він використовує насос низького тиску, перш ніж приступити до повного елюювання при більш високих тисках. Вбудований інжектор дозволяє легко контролювати обсяг зразка. Насос високого тиску змушує (спеціально виміряний) зразок в потік елюенту, який продовжує переносити зразок через колону. Цей метод дозволяє забезпечити специфічні розведення і більшу гнучкість. Для зразків, які не потребують розведення або негайної взаємодії з елюентом, корисний інжектор в колонці. Це дозволяє передавати зразок безпосередньо в упаковану колону, а рухливу фазу потім проходити через колону.

Насос

Існування надкритичної рідини, як обговорювалося раніше, залежить від високих температур і високих тисків. Насос відповідає за подачу високого тиску. Надавлюючи газ (або рідину), це може призвести до того, що речовина стане досить щільною, щоб виявляти ознаки потрібної надкритичної рідини. Оскільки тиск пари з теплом для створення надкритичної рідини, вони, як правило, дуже близько один до одного на приладі.

Піч

Піч, як згадувалося раніше, існує для нагрівання рухомої фази до бажаної температури. У випадку з SFC бажаною температурою завжди є критична температура надкритичної рідини. Ці печі точно контролюються та стандартні для SFC, ВЕРХ та GC.

Детектор

Поки що існував один значною мірою не помічений компонент машини SFC: детектор. Технічно не є частиною процесу хроматографічного поділу, детектор все ще відіграє важливу роль: виявлення компонентів розчину. Хоча SFC має на меті відокремити компоненти з хорошою роздільною здатністю (висока чистота, інші компоненти не змішуються), детектор має на меті визначити, з чого складається кожен з цих компонентів.

Два детектори, які найчастіше зустрічаються на приладах SFC, - це або детектори іонізації полум'я (FID), або мас-спектрометри (MS):

FID працюють через іонізацію зразка в полум'ї, що працює на водні. Роблячи це, вони виробляють заряджені частинки, які потрапляють на електроди, а частинки згодом кількісно оцінюються та ідентифікуються.
МС діє шляхом створення іонізованого розпилення зразка, а потім відділення іонів на основі співвідношення маса/заряд. Співвідношення маса/заряд побудовано на тлі великої кількості іонів і створює «відбиток пальця» для ідентифікованої хімічної речовини. Цей хімічний відбиток потім зіставляється з базою даних, щоб виділити, яка сполука вона була. Це можна зробити для кожного унікального елюції, роблячи SFC ще більш корисним, ніж якби він стояв окремо.

Зразок

Взагалі кажучи, зразки потребують невеликої підготовки. Єдина головна вимога полягає в тому, що він розчиняється в розчиннику менш полярному, ніж метанол: він повинен мати діелектричну проникність нижче 33, оскільки СО ₂ має низьку полярність і не може легко елітувати полярні зразки. Для боротьби з цим в рухливу фазу додаються модифікатори.

Стаціонарна фаза

Стаціонарна фаза - це нейтральне з'єднання, яке виступає джерелом «тертя» для певних молекул у зразку, коли вони ковзають по колоні. Кремній притягує полярні молекули і, таким чином, молекули прикріплюються сильно, тримаючись, поки достатня кількість рухомої фази не пройде, щоб залучити їх. Поєднання властивостей в стаціонарній фазі і рухомій фазі допомагають визначити роздільну здатність і швидкість експерименту.

Мобільна фаза

Рухлива фаза (надкритична рідина) проштовхує зразок через колону і елюює окремі, чисті, зразки. Тут вступають в дію властивості надкритичної рідини з високою щільністю, високою дифузійністю та низькою в'язкістю. Завдяки цим трьом властивостям рухлива фаза здатна адекватно взаємодіяти зі зразком, швидко проштовхуватися через нього і сильно орати пробу, щоб відокремити його назовні. Рухлива фаза також частково визначає, як вона відокремлюється: вона спочатку здійснюватиме подібні молекули, ті, що мають подібні полярності, і поступово слідувати за молекулами з більшою полярністю.

Модифікатори

Модифікатори додаються до рухомої фази, щоб грати з її властивостями. Як уже згадувалося кілька разів раніше, СО ₂ надкритичної рідини не вистачає полярності. Для того, щоб додати полярності рідини (не викликаючи реактивності), часто додається полярний модифікатор. Модифікатори зазвичай трохи піднімають критичний тиск і температуру рухомої фази, але натомість додають фазі полярність і призводять до повністю дозволеного зразка. На жаль, при занадто великій кількості модифікатора потрібні більш високі температури і тиск і підвищується реакційна здатність (що небезпечно і погано для оператора). Модифікатори, такі як етанол або метанол, використовуються в невеликих кількостях, якщо це необхідно для рухомої фази, щоб створити більш полярну рідину.

Переваги надкритичної рідинної хроматографії

Очевидно, що SFC володіє деяким надзвичайним потенціалом, наскільки хроматографічні методи йдуть. Він володіє деякими неймовірними можливостями, які дозволяють ефективно і точно вирішувати суміші. Нижче наведено резюме його переваг та недоліків, укладених проти інших звичайних (конкуруючих) методів хроматографії.

Переваги перед ВЕРХ

Оскільки надкритичні рідини мають низьку в'язкість, аналіз відбувається швидше, спостерігається набагато нижчий перепад тиску по колоні, і можна використовувати відкриті трубчасті колони.
Потрібні менші довжини колони (10-20 м для SFC проти 15-60 м для ВЕРХ) через високу дифузійність надкритичної рідини. Більше взаємодій може відбуватися за менший проміжок часу/відстані.
Роздільна здатність набагато більша (5x), ніж ВЕРХ через високу дифузійність надкритичної рідини. Більше взаємодій призводить до кращого поділу компонентів за менший проміжок часу.

Переваги перед ГК

Здатний аналізувати багато розчинених речовин без дериватизації, оскільки немає необхідності перетворювати більшість полярних груп у неполярні.
Може легше аналізувати термічно лабільні сполуки з високою роздільною здатністю, оскільки він може забезпечити більш швидкий аналіз при більш низьких температурах.
Може аналізувати розчинені речовини з високою молекулярною масою завдяки їх більшій солюбізуючої здатності.

загальні недоліки

Неможливо проаналізувати надзвичайно полярні розчинені речовини через відносно неполярну рухливу фазу, CO ₂.

Додатки

Хоча використання SFC було в основному органічно орієнтованим, все ще існує кілька способів розділення неорганічних сполук сумішей за допомогою методу. Тут розглядаються два основних - поділ хіральних сполук (переважно комплексів метал-ліганд) і органометаліків.

Хіральні сполуки

Для хіральних молекул процедури та вибір колони в SFC дуже схожі на ті, що використовуються у ВЕРХ. Упакований хіральною стаціонарною фазою типу целюлози (або деякою іншою хіральною стаціонарною фазою), зразок протікає через хіральну сполуку, і лише молекули з відповідною хіральністю будуть прилипати до колони. Запустивши чисту суперкритичну рідинну рухливу фазу CO ₂, енантіомер, що не прилипає, спочатку елютуватиме, а потім врешті-решт (але повільно) з іншим.

У галузі неорганічної хімії рацемічна суміш Co (acac) ₃, обидва ізомери, показані на малюнку,\(\PageIndex{6}\) була вирішена за допомогою хіральної стаціонарної фази на основі целюлози. Метод SFC був одним з кращих і найбільш ефективних інструментів в аналізі хірального з'єднання. Хоча SFC легко розділяє координатні ковалентні сполуки, не потрібно використовувати такий великий інструмент для розділення його сумішей, оскільки існує багато простіших методів.

\(\PageIndex{6}\)Малюнок Два ізомери Co (acac) ₃ у рацемічній суміші, які були дозволені SFC.

органометаліки

Багато d-блокових органометаліків мають високу реакцію і легко розкладаються на повітрі. SFC пропонує спосіб хроматографа сумішей великих, незвичайних металоорганічних сполук. Великі суміші металоорганічних сполук на основі кобальту та родію були розділені за допомогою SFC (рис.\(\PageIndex{7}\)), не піддаючи сполуки повітрю.

Рисунок\(\PageIndex{7}\) Приклади сумішей металоорганічних сполук на основі кобальту та родію, розділених SFC. Адаптовано з сполук I Бругейм, E Фуладі, E. Лунданес, Т. Грейброкк, *J. Мікроколонка вересня*, 2001, 13, 156.

За допомогою стаціонарної фази силоксанів, пов'язаних з киснем частинок кремнію з різними приєднаними замісниками, органометаліки були вирішені на основі розміру та заряду. Завдяки неполярним, високодифузійним та високим в'язким властивостям 100% суперкритичної рідини СО ₂ суміш була розчинена та проаналізована за допомогою детектора іонізації полум'я. Визначено, що метод досить чутливий для виявлення домішок 1%. Оскільки ефективність SFC настільки вражає, потенціал для нього в металоорганічному полі величезний. Виявлення домішок до 1% показує обіцянку не тільки попередніх даних в експериментах, але й контролю якості.

Висновок

Хоча це може мати свої недоліки, SFC залишається невикористаним ресурсом у способах хроматографії. Переваги використання надкритичних рідин в якості мобільних фаз демонструють, як роздільну здатність можна збільшити, не жертвуючи часом або збільшуючи довжину колони. Тим не менш, це все ще добре використовуваний ресурс в органічних, біомедичних та фармацевтичної промисловості. SFC демонструє перспективність як надійний спосіб розділення та аналізу сумішей.