3.2: Високоефективна рідинна хроматографія
- Page ID
- 18793
Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) - це техніка в аналітичній хімії, яка використовується для поділу компонентів у суміші, а також для ідентифікації та кількісної оцінки кожного компонента. Спочатку він був відкритий як аналітичний прийом на початку ХХ століття і вперше був використаний для поділу кольорових сполук. Слово хроматографія означає кольорове письмо. Саме ботанік М.С. Цветт (рис.\(\PageIndex{1}\)) винайшов цей метод приблизно в 1900 році для вивчення пігментів листя (переважно хлорофілу). Він відокремлював пігменти виходячи з їх взаємодії зі стаціонарною фазою. У 1906 році Цветт опублікував дві фундаментальні статті, детально описуючи різні аспекти рідинно-адсорбційної хроматографії. Він також зазначив, що, незважаючи на свою назву, інші речовини також можуть бути розділені хроматографією. Сучасна високоефективна рідинна хроматографія розроблена з цього поділу; ефективність поділу, універсальність та швидкість були значно покращені.
Молекулярні види, що піддаються поділу, існують у зразку, який складається з аналітів та матриці. Аналіти - це молекулярні види, що цікавлять, а матриця - решта компонентів у зразку. Для хроматографічного поділу зразок вводиться в проточну рухливу фазу, яка проходить стаціонарну фазу. Рухлива фаза є рухомою рідиною і характеризується своїм складом, розчинністю, ультрафіолетовою прозорістю, в'язкістю та змішуваністю з іншими розчинниками. Стаціонарна фаза - це стаціонарне середовище, яке може бути застояною насипною рідиною, рідким шаром на твердій фазі або міжфазним шаром між рідиною і твердим. У ВЕРХ стаціонарна фаза, як правило, у вигляді колони, упакованої дуже дрібними пористими частинками, а рідка рухома фаза переміщується через колону насосом. Розробка ВЕРХ - це головним чином розробка нових колонок, що вимагає нових частинок, нових стаціонарних фаз (покриття частинок) та вдосконалених процедур упаковки колони. Зображення сучасної ВЕРХ наведено на малюнку\(\PageIndex{2}\).
Контрольно-вимірювальні прилади
Основні компоненти ВЕРХ показані на малюнку\(\PageIndex{3}\). Роль насоса полягає в тому, щоб змусити рідину (рухливу фазу) через певну швидкість потоку (мілілітри в хвилину). Інжектор служить для введення проби рідини в проточний потік рухомої фази. Колонка є найбільш центральним і важливим компонентом ВЕРХ, а стаціонарна фаза колони розділяє цікаві компоненти зразка, використовуючи різні фізичні та хімічні параметри. Детектор призначений для виявлення окремих молекул, які виділяються з колони. Комп'ютер зазвичай функціонує як система даних, і комп'ютер не тільки контролює всі модулі приладу ВЕРХ, але він приймає сигнал від детектора і використовує його для визначення часу утримання, компонентів зразка та кількісного аналізу.
Колони
Застосовувалися різні механізми поділу, засновані на різній властивості стаціонарної фази колони. Основні типи включають нормальну фазову хроматографію, хроматографію зворотної фази, іонний обмін, хроматографію для виключення розміру та афінну хроматографію.
Нормально-фазова хроматографія
При цьому методі колони набиваються полярними, неорганічними частинками і для пробігу по стаціонарній фазі використовується неполярна рухлива фаза (табл.\(\PageIndex{1}\)). Нормальна фазова хроматографія в основному використовується для очищення сирих зразків, поділу дуже полярних зразків або аналітичних поділів тонкошаровою хроматографією. Однією з проблем при використанні цього методу є те, що вода є сильним розчинником для нормально-фазової хроматографії, сліди води в рухомій фазі можуть помітно впливати на утримання зразка, а після зміни рухомої фази вирівнювання колони відбувається дуже повільно.
| Стаціонарна фаза | Мобільна фаза | |
|---|---|---|
| Нормальна фаза | Полярний | неполярний |
| Зворотна фаза | неполярний | Полярний |
Зворотно-фазова хроматографія
При зворотно-фазової (РП) хроматографії стаціонарна фаза має гідрофобний характер, в той час як рухлива фаза має полярний характер. Це реверс нормально-фазової хроматографії (табл.\(\PageIndex{2}\)). Взаємодії в РП-ВЕРХ вважаються гідрофобними силами, і ці сили викликані енергіями, що виникають внаслідок порушення диполярної структури розчинника. Поділ, як правило, базується на поділі аналіту між стаціонарною фазою та рухомою фазою. Молекули розчинених речовин знаходяться в рівновазі між гідрофобною стаціонарною фазою і частково полярною рухомою фазою. Більш гідрофобна молекула має більш тривалий час утримання, тоді як іонізовані органічні сполуки, неорганічні іони та молекули полярних металів показують мало або зовсім не затримують час.
Іонообмінна хроматографія
Механізм іонообміну заснований на електростатичних взаємодіях між гідратованими іонами із зразка та протилежно зарядженими функціональними групами на стаціонарній фазі. Для поділу використовуються два типи механізмів: в одному механізмі елюція використовує рухливу фазу, яка містить конкуруючі іони, які замінили б іони аналітів і відштовхували їх від колони; інший механізм полягає в додаванні комплексоутворюючого реагенту в рухомій фазі та зміні видів зразків від їх початкова форма. Ця модифікація на молекулах призведе їх до елюції. Крім обміну іонів, іонообмінні стаціонарні фази здатні утримувати специфічні нейтральні молекули. Цей процес пов'язаний з утриманням, заснованим на утворенні комплексів, і специфічні іони, такі як перехідні метали, можуть утримуватися на катионообмінної смолі і все ще можуть приймати однопарні електрони від донорських лігандів. Таким чином, нейтральні молекули ліганду можуть утримуватися на смолах, оброблених іонами перехідних металів.
Сучасний іонний обмін здатний до кількісних застосувань при досить низьких концентраціях розчинених речовин і може бути використаний при аналізі водних зразків на поширені неорганічні аніони (діапазон від 10 мкг/л до 10 мг/л). Катіони металів та неорганічні аніони розділені переважно іонними взаємодіями з іонообмінною смолою. Одним з найбільших промислових користувачів іонного обміну є сектор харчових продуктів та напоїв для визначення азоту, сірки та фосфорсодержащих видів, а також галогенідних іонів. Також іонний обмін може бути використаний для визначення розчинених неорганічних і органічних іонів в природних і очищених водах.
Хроматографія виключення розміру
Це хроматографічний метод, який розділяє молекули в розчині виходячи з розміру (гідродинамічного обсягу). Ця колонка часто використовується для відділення макромолекул і макромолекул від малих молекул. Після введення аналіту в колону молекули менше розміру пор стаціонарної фази надходять в пористі частинки під час поділу і протікають по хитромудрих каналах стаціонарної фази. Таким чином, менші компоненти мають довший шлях для переміщення та вилучення з колони пізніше, ніж більші. Оскільки молекулярний об'єм пов'язаний з молекулярною масою, очікується, що обсяг утримання буде певною мірою залежати від молекулярної маси полімерних матеріалів. Співвідношення між часом утримання і молекулярною масою показано на малюнку\(\PageIndex{4}\).
Зазвичай тип методу розділення ВЕРХ, який слід використовувати, залежить від хімічної природи та фізико-хімічних параметрів зразків. \(\PageIndex{5}\)На малюнку показана блок-схема попереднього відбору для методу поділу відповідно до властивостей аналіту.
Детектори
Детектори, які зазвичай використовуються для рідинної хроматографії, включають ультрафіолетово-видимі детектори поглинання, детектори показника заломлення, детектори флуоресценції та мас-спектрометрію. Незалежно від класу, LC-детектор в ідеалі повинен мати характеристики близько 10 -12 -10 -11 г/мл, а лінійний динамічний діапазон п'яти або шести порядків. Основні характеристики детекторів, що підлягають оцінці, включають динамічний діапазон, індекс відгуку або лінійність, лінійний динамічний діапазон, реакцію детектора, чутливість детектора тощо.
Серед цих детекторів найбільш економічними і популярними методами є детектори УФ і коефіцієнта заломлення (RI). Вони мають досить широку селективність, розумні межі виявлення більшу частину часу. RI детектор був першим детектором, доступним для комерційного використання. Цей метод особливо корисний при розділенні ВЕРХ відповідно до розміру, а вимірювання прямо пропорційно концентрації полімеру і практично не залежить від молекулярної маси. Чутливість RI становить 10 -6 г/мл, лінійний динамічний діапазон - від 10 -6 до 10 -4 г/мл, а індекс відгуку становить від 0,97 до 1,03.
УФ-детектори реагують тільки на ті речовини, які поглинають ультрафіолетове світло на довжині хвилі вихідного світла. Дуже багато сполук поглинають світло в УФ-діапазоні (180-350 нм), включаючи речовини, що мають одну або кілька подвійних зв'язків, і речовини, що мають нерозділені електрони. і зв'язок між інтенсивністю ультрафіолетового світла, що передається через клітину, і концентрацією розчиненої речовини задається законом Пива,\ ref {1} і\ ref {2}.
\[ I_{T} \ =\ I_{0} e^{kcl} \label{1} \]
\[ ln(I_{T})\ =\ ln(I_{0}) (-kcl) \label{2} \]
Де I 0 - інтенсивність світла, що надходить в клітину, а I T - світло, що передається через клітинку, l - довжина шляху клітини, c - концентрація розчиненої речовини, а k - молярний коефіцієнт поглинання розчиненої речовини. УФ-детектори включають УФ-детектор з фіксованою довжиною хвилі та багатохвильовий УФ-детектор. УФ детектор з фіксованою довжиною хвилі має чутливість 5* 10 -8 г/мл, має лінійний динамічний діапазон між 5* 10 -8 і 5* 10-4 г/мл, а індекс відгуку становить від 0,98 до 1,02. Багатохвильовий УФ-детектор має чутливість 10 -7 г/мл, лінійний динамічний діапазон становить від 5* 10 -7 до 5* 10 -4 г/мл, а індекс відгуку становить від 0,97 до 1,03. УФ-детектори можуть бути ефективно використані для зворотно-фазового поділу та іонообмінної хроматографії. УФ-детектори мають високу чутливість, економічно доступні і прості в експлуатації. Таким чином, УФ-детектор є найпоширенішим вибором детектора для ВЕРХ.
Інший метод, мас-спектрометрія, має певні переваги перед іншими методами. Масові спектри можуть бути отримані швидко; для аналізу потрібна лише невелика кількість (суб-мкг) зразка, а дані, надані спектрами, дуже інформативні для молекулярної структури. Мас-спектрометрія також має сильні переваги специфічності та чутливості порівняно з іншими детекторами. Комбінація HPLC-MS орієнтована на специфічне виявлення та потенційну ідентифікацію хімічних речовин у присутності інших хімічних речовин. Однак важко пов'язати рідинну хроматографію з мас-спектрометром, оскільки спочатку потрібно видалити всі розчинники. Загальний використовуваний інтерфейс включає електророзпилення іонізацію, фотоіонізацію атмосферного тиску та іонізацію термоспрею.
Параметри, пов'язані з розділенням ВЕРХ
Швидкість потоку
Швидкість потоку показує, наскільки швидко рухлива фаза рухається по колоні, і часто використовується для розрахунку споживання рухомої фази в заданий часовий проміжок. Існують об'ємний витрата U та лінійний витрата u. Ці два витрати пов'язані\ ref {3}, де A - площа каналу для потоку,\ ref {4}.
\[ U = Au \label{3} \]
\[ A\ =\ (1/4) \pi \varepsilon d^{2} \label{4} \]
Час утримання
Час утримання (t R) можна визначити як час від ін'єкції зразка до часу елюції з'єднання, і він береться на вершині піку, який належить до конкретних молекулярних видів. Час утримання визначається кількома факторами, включаючи структуру конкретної молекули, швидкість потоку рухомої фази, розмір колони. А мертвий час t 0 визначається як час для незбереженого молекулярного виду, щоб вилучити з колони.
Обсяг утримання
Обсяг утримання (V R) визначається як обсяг рухомої фази, що протікає від часу ін'єкції до відповідного часу утримання молекулярного виду, і пов'язані\ ref {5}. Обсяг збереження, пов'язаний з мертвим часом, відомий як мертвий том V 0.
\[ V_{R} \ =\ U_{tR} \label{5} \]
Швидкість міграції
Швидкість міграції можна визначити як швидкість, з якою вид рухається через колону. А швидкість міграції (U R) обернено пропорційна часу утримання. Якщо рухається тільки частина молекул, які присутні в рухомій фазі. Значення швидкості міграції задається за допомогою\ ref {6}.
\[ u_{R} \ =\ u*V_{mo}/(V_{mo}+V_{st}) \label{6} \]
Коефіцієнт ємності
Коефіцієнт ємності (k) - це співвідношення зменшеного часу утримання та часу мертвого часу,\ ref {7}.
\[ K \ =\ (t_{R} - t_{0})/t_{0} \ =\ (v_{R} - v_{0})/v_{0} \label{7} \]
Стан рівноваги і співвідношення фаз
При поділі молекули, що проходять через колону, також можна розглядати як знаходяться в безперервній рівновазі між рухомою фазою і стаціонарною фазою. Ця рівновага може регулюватися постійною рівноваги K, визначеною як\ ref {8}, в якій C mo - молярна концентрація молекул у рухомій фазі, а C st - молярна концентрація молекул у стаціонарній фазі. Константа рівноваги K також може бути записана як\ ref {9}.
\[ K\ =\ C_{st}/C_{mo} \label{8} \]
\[ K\ =\ k(V_{0}/V_{st}) \label{9} \]
Перевага ВЕРХ
Найважливішим аспектом ВЕРХ є висока роздільна здатність, яка дозволяє аналізувати партії декількох компонентів. Навіть якщо зразок складається з суміші, ВЕРХ дозволить розділити, виявити та кількісно визначити цільові компоненти. Також при відповідній умові можна досягти високого рівня відтворюваності з коефіцієнтом варіації, що не перевищує 1%. Крім того, він має високу чутливість при низькому споживанні зразка. ВЕРХ має одну перевагу перед колонкою GC в тому, що аналіз можливий для будь-якого зразка може бути стабільно розчинений в елюенті і не потрібно випаровуватися. З цієї причини ВЕРХ використовується набагато частіше в галузі біохімії та фармацевтики, ніж стовпець GC.