1.8: Структурна модель

Аналіз і інтерпретація функції електронної щільності, тобто роздільна здатність кристалічної структури (молекулярної або немолекулярної) призводить до початкового розподілу атомних позицій всередині одиничної клітини, які можуть бути представлені точками або малими сферами:

Зліва: Початкова модель тривимірної структури молекули. Атоми, також мічені, представлені малими сферами. Центр: Початкова модель тривимірної структури молекули. Незважаючи на підвищену складність або красу моделі, рівень інформації в основному такий же, як у моделі зліва. Праворуч: Початкова модель тривимірної структури молекули, включаючи її кристалічну структуру, тобто молекулярну упаковку всередині одиничної клітини.

Після того, як структурна модель буде завершена, маючи стереохімічний сенс і включаючи її кришталеву упаковку, необхідно використовувати всю інформацію, яку ми можемо витягти з експериментальних даних, оскільки дифракційна картина, як правило, містить набагато більше даних (інтенсивності), ніж потрібно для знаходження атомів в їх 3-вимірні координати. Наприклад, для структури середнього розміру, з 50 незалежними атомами в асиметричній одиниці (в структурній одиниці, яка повторюється операціями симетрії), дифракційна картина зазвичай містить близько 2500 структурних факторів, що передбачає приблизно 50 спостережень на атом (кожному атому потрібно 3 координати). Однак для більш складних структур, як і у випадку з макромолекулами, кількість експериментальних даних, наявних в нормі, не досягає цих меж.

ДООПРАЦЮВАННЯ КІНЦЕВОЇ МОДЕЛІ

Основними параметрами, пов'язаними з тривимірною структурою, є, очевидно, три позиційні координати (x, y, z) для кожного атома, наведені в терміні одиничних фракцій комірки. Але, в цілому, з огляду на згадане вище експериментальне перевизначення, атомна модель може стати більш складною. Наприклад, пов'язування кожного атома з додатковим параметром, що відображає його тепловий коливальний стан, у першому підході у вигляді ізотропної (сферичної) теплової вібрації навколо його положення рівноваги. Цей новий параметр зазвичай відображається через різний радіус сфери, що представляє атом. Таким чином, ізотропна структурна модель буде представлена 4 змінними на атом: 3 позиційні + 1 теплові.

Однак для малих і середніх структур (до декількох сотень атомів) дифракційний експеримент зазвичай містить достатньо даних для завершення моделі теплової вібрації, пов'язуючи тензор (6 змінних) з кожним атомом, який виражає стан вібрації анізотропним чином, тобто розрізняючи між різними напрямками вібрації у вигляді еліпсоїда (який нагадує форму бейсболу). Тому кристалографічна анізотропна модель потребує 9 змінних на атом (3 позиційні + 6 коливальних).

Зліва: Три зв'язані атоми, представлені ізотропною моделлю теплової вібрації Праворуч: Ті ж три атоми, показані зліва, але представлені за допомогою анізотропної моделі теплової вібрації

Зліва: Анізотропна модель 3-вимірної структури молекули, що показує деякі атоми з сусідніх молекул.

Праворуч: Анізотропна модель тривимірної структури молекули, що показує її кристалічну упаковку.

Незалежно від типу моделі, ізотропної або анізотропної, вищезгаданий надлишок експериментальних даних дозволяє описати структурну модель з точки зору дуже точних атомних параметрів (позиційних і коливальних), що призводять до дуже точних геометричних параметрів всієї структури (міжатомної). відстані, кути зв'язку і т.д.).

Ця уточнена модель отримана аналітичним методом найменших квадратів. Використовуючи цю методику, атомам дозволяється трохи «рухатися» зі своїх попередніх позицій і теплові фактори застосовуються до кожного атома так, щоб дифракційна картина, розрахована за допомогою цієї моделі, по суті була такою ж, як експериментальна (спостережується), тобто мінімізація відмінностей між розрахунковим і спостерігаються структурні фактори. Цей процес здійснюється шляхом мінімізації функції:

\[\sum w | |F_o| - |F_c| |^2 → 0\]

Функція найменших квадратів, яка використовується для уточнення кінцевої моделі кристалічної структури

де\(w\) являє собою коефіцієнт «ваги», присвоєний кожному спостереженню (інтенсивності), зважуючи ефекти менш точних спостережень проти більш точних і уникаючи можливих систематичних помилок в експериментальних спостереженнях, які можуть змістити модель. Fo і Fc є де спостережувані і розраховані структурні коефіцієнти відповідно.

Хоча зазвичай згадане експериментальне надмірне визначення забезпечує успіх цього аналітичного процесу уточнення, він завжди повинен контролюватися за допомогою стереохімічних аспектів, тобто гарантуючи, що позиційні рухи атомів є розумними і, отже, генерують відстані в межах очікувані значення. Аналогічно, коефіцієнти теплової вібрації (ізотропні або анізотропні), пов'язані з атомами, завжди повинні показувати розумні значення.

На додаток до вищезгаданого контролю зміни моделі в процесі уточнення, здається очевидним, що (якщо все піде добре) додатково розраховується дифракційна картина (F _c) з уточненою моделлю ( координати (+ коефіцієнти теплової вібрації) покаже зростаючу схожість із спостережуваним малюнком (F _o). Порівняння обох моделей (спостережуваних проти обчислених) здійснюється за допомогою так званого\(R\) параметра, який визначає коефіцієнт «розбіжності» між двома закономірностями:

\[R = \dfrac{\sum [ | |F_o| - |F_c| | ]}{|F_o|}\]

Коефіцієнт розбіжності структурної моделі, розрахований за відмінностями між спостережуваними та розрахунковими структурними факторами з кінцевою моделлю

Значення коефіцієнта розбіжності (R) оцінюється у відсотках (%), тобто множиться на 100, так що «добре» розв'язані структури, з відповідним ступенем точності, показуватимуть коефіцієнт R нижче 0,10 (10%), що означає, що розрахункова закономірність відрізняється від спостережуваного (експериментального) менш ніж на 10%.

Дифракційні моделі макромолекул (ферментів, білків тощо) зазвичай не показують такого великого перевизначення експериментальних даних, і тому важко досягти анізотропної кінцевої моделі. Більше того, в цих випадках значення R фактора більше, ніж для малих і середніх молекул, так що значення близько або нижче 20% зазвичай є прийнятними. Крім того, в результаті такої відносної дефіциту експериментальних даних аналітична процедура уточнення (найменші квадрати) повинна поєднуватися з інтерактивним процесом стереохімічного моделювання та шляхом накладення певних «м'яких обмежень» на молекулярну геометрію.

ПЕРЕВІРКА МОДЕЛІ

Надійність структурної моделі повинна бути оцінена за допомогою декількох випробувань, процедури, відомої як валідація моделі. Таким чином, структурна модель повинна постійно перевірятися та перевірятися з використанням послідовних стереохімічних критеріїв (наприклад, довжина зв'язків та кути зв'язку повинні бути прийнятними). Наприклад, відстань C—O 0,8 Ангстрема не було б прийнятним для карбонільної групи (C = O). Аналогічно, кути зв'язку також повинні відповідати прийнятній геометрії. Ці критерії дуже обмежувальні для малих або середніх структур, але навіть в структурах макромолекул вони повинні відповідати деяким мінімальним критеріям.

Максимальні значення дисперсії, загальноприйняті для міжатомних відстаней і кутів зв'язку в структурній моделі макромолекули

У випадку білків пептидний зв'язок (зв'язок між двома послідовними амінокислотами) також повинна задовольняти деяким геометричним обмеженням. Кути кручення цього зв'язку не повинні сильно відхилятися від прийнятних значень звичайних конформацій, показаних амінокислотними ланцюгами, як показано на так званому графіку Рамачандрана:

Зліва: Схематичне зображення пептидного зв'язку, що показує два кути кручення (ψ і Φ), що визначають його.

Праворуч: Графік Рамачандрана, що показує різні дозволені (прийнятні) області для кутів кручення пептидних зв'язків у макромолекулі. Різні області залежать від різних структурних механізмів (α-спіралі, β-листи тощо)

Аналогічно значення теплових факторів, пов'язаних з кожним атомом, повинні показувати фізично прийнятні значення. Ці параметри обумовлюють теплову коливальну рухливість різних конструктивних деталей. Таким чином, у структурі макромолекули ці значення повинні відповідати внутрішньому або зовнішньому розташуванню ланцюга, як правило, нижчими для внутрішніх частин і вищими для зовнішніх частин поблизу розчинника.

 

СТУПІНЬ НАДІЙНОСТІ МОДЕЛІ

Модель, яка була «перевірена» за критеріями, описаними вище, тобто демонструє:

• розумне узгодження між спостережуваними та розрахованими структурними факторами,
• відстані зв'язку, кути зв'язку та кути кручення, які відповідають стереохімічним критеріям, і
• фізично обгрунтовані теплові вібраційні фактори,

є надійною моделлю. Однак поняття надійності не є кількісним параметром, який можна записати в терміні єдиного числа. Тому для інтерпретації структурної моделі до її логічних наслідків потрібно мати на увазі, що це лише спрощене уявлення, витягнуте з функції електронної густини:

\[\rho(x y z)=\frac{1}{V} \sum_{\substack{h k l}}^{+\infty}|F(h k l)| \cdot e^{-2 \pi i[h x+k y+l z-\phi(h k l)]}\]

на якому атоми були розташовані і на які впливають деякі умови, описані в іншому розділі, який ми пропонуємо вам прочитати.

Але, в будь-якому випадку, добре виконана кристалографічна робота завжди забезпечує атомні параметри (позиційні та вібраційні) разом з ними пов'язані з ними точні оцінки. Це означає, що будь-який прямий кристалографічний параметр (атомні координати і коефіцієнти вібрації) або похідний (відстані, кути і т.д.) зазвичай виражається числом, за яким слідує його стандартне відхилення (в дужках), що впливає на останню цифру. Наприклад, міжатомна відстань, виражена як 1.541 (2) Angstroms, означає відстань 1,541 і стандартне відхилення 0,002.

АБСОЛЮТНА КОНФІГУРАЦІЯ (АБО АБСОЛЮТНА СТЕРЕОХІМІЯ)

Як зазначено в попередньому розділі, всі молекули або структури, в яких немає ні дзеркальних площин, ні центрів симетрії, мають абсолютну конфігурацію, тобто те, що вони відрізняються від своїх дзеркальних відображень (їх не можна накладати).

 

Структурні моделі, що показують два енантіомери сполуки (дві молекули є дзеркальними зображеннями)

Ці конкретні структурні відмінності, дуже важливі щодо молекулярних властивостей, можуть бути однозначно визначені за допомогою дифракційного експерименту (без використання будь-якого зовнішнього стандарту). Це може бути здійснено за допомогою так званого ефекту аномального розсіювання, який атоми показують, коли використовуються відповідні довжини хвиль рентгенівського випромінювання. Ця особливість також дуже успішно використовується як метод вирішення фазової задачі для високомолекулярних кристалів. Не здається складним зрозуміти, що молекулярні енантіомери мають різні властивості, оскільки врешті-решт вони є різними молекулами, але щодо їх біологічної активності (якщо така є) ситуація особливо вражає.

Енантіомерні молекули, які представлені на лівому малюнку, були введені на ринок фармацевтичною компанією і, очевидно, проявили різні властивості.

Властивості DARVON (декстропропоксифен Напсилат) доступні за цим посиланням, тоді як виробництво NOVRAD (Левопропоксифен Напсилат) було припинено.

Експериментальний дифракційний сигнал, що дозволяє цю структурну диференціацію, є наслідком того, що атомний коефіцієнт розсіювання не поводиться як дійсне число, коли частота рентгенівських променів аналогічна власній частоті. атомного поглинання. Див. також главу, присвячену аномальному розсіюванню.

За цих умов Закон Фриделя більше не виконується і, отже, структурні фактори, такі як |F _{h, k, l} | і | F _{-h, -k, -l} | будуть трохи відрізнятися. Ці відмінності оцінюються в терміні так званих оцінок Біжвоєта, які порівнюють співвідношення спостережуваних структурних факторів для таких пар відображення з відповідними співвідношеннями для розрахункових структурних факторів за допомогою двох можливих абсолютних моделей. Лише одне з цих двох порівнянь збереже однаковий тип упередженості:

\[\frac{|F(h k l)|_{o}}{|F(\bar{h} \bar{k} \bar{l})|_{o}} \text { vs. } \frac{|F(h k l)|_{c}}{|F(\bar{h} \bar{k} \bar{l})|_{c}}\]

Порівняння коефіцієнтів Бійвоет - Йоганнес Мартін Бійвоет (1892-1980)

Таким чином, якщо частка між спостережуваними структурними факторами становить <1, той самий коефіцієнт для обчислюваних структурних факторів також повинен бути <1. Або, навпаки, обидва частки повинні бути >1. Якщо це вірно для великої кількості пар відображення, це вкаже на те, що абсолютна модель є правильною. Якщо це не так, структурну модель доводиться інвертувати.

Зацікавлений читач також повинен заглянути в веб-сторінки про аномальне розсіювання, підготовлені Етаном Мерріттом.

КІНЦЕВИЙ РЕЗУЛЬТАТ

Інформація, що описує остаточну кристалографічну модель, складається з:

• Дані дифракційного експерименту: довжина хвилі та дифракційна картина (інтенсивність тисяч або навіть сотень тисяч дифрагованих хвиль з їх індексами hkl),
• Одиничні розміри комірки, отримані від дифракційного малюнка (від зворотної комірки),
• Симетрія, присутня в кристалі, походить від зворотної решітки (від дифракційного малюнка), і
• Атомні положення (координати і коефіцієнти теплової вібрації) і, при необхідності, так званий фактор популяції, як зазначено в таблиці нижче.

Атомні позиції зазвичай задаються як дробові координати (фракції осей одиничних осередків), але іноді, особливо для макромолекул, де інформація зазвичай відноситься до ізольованої молекули, вони задаються як абсолютні координати, тобто виражені в Ангстремі і відносяться до системи ортогональних осі, незалежні від кристалографічних (див. Нижче).

Інформація про декілька атомах білкової структури використовує так званий формат PDB (Protein Data Bank), тобто атомні координати в Ангстреме на системі ортогональних осей, відмінних від кристалографічних. Для наочності передбачувані стандартні відхилення були опущені.

Фактор популяції - це частка атома, що знаходиться в конкретному положенні, хоча цей фактор зазвичай дорівнює 1. Значення цього параметра вимагає пояснення новачкові, так як можна було зрозуміти, що атоми можна розділити на частини, що явно не має фізичного сенсу. Через атомних коливань, а також через те, що дифракційний експеримент має тривалість в часі, можливо, що в деяких одиничних клітинок атоми відсутні. Таким чином, замість повної заповненості (коефіцієнт популяції = 1) відповідний ділянку, в середній одиничній клітині, буде містити лише частку атома. У цих випадках кажуть, що кристалічна решітка має дефекти, а фактори популяції менше 1 відображають частку одиничних клітин, де зайнята певна атомна позиція. Очевидно, що частка одиничних клітин, де однакова позиція порожня, доповнює фактор популяції до єдності. Тому кристалографічна модель відображає середню структуру всіх одиничних осередків за час експерименту.

Атомні координати і взагалі вся інформація, зібрана в результаті кристалографічного дослідження, зберігається в доступних базах даних. Існують різні бази даних, в залежності від типу з'єднання або молекули, але про це піде мова в іншому розділі цих сторінок.

ГРАФІЧНІ ЗОБРАЖЕННЯ МОДЕЛІ

Остаточна структурна модель (атомні координати, теплові фактори і, можливо, фактори популяції) безпосередньо надають додаткову інформацію, яка призводить до детального знання самої структури, включаючи довжини зв'язків, кути зв'язків, кути кручення, молекулярні площини, дипольний імпульс тощо, і будь-який інший структурна деталь, яка може бути корисною для розуміння функціональності та/або властивостей досліджуваного матеріалу.

У разі складних біологічних молекул використання високоякісних графічних процесорів і відносно простих моделей значно полегшує розуміння взаємозв'язку між структурою і функцією, як показано на малюнку зліва.

В даний час доступні обчислювальні та графічні методи дозволяють нам отримати красиві та дуже описові моделі, які допомагають візуалізувати та розуміти структури, як показано на прикладах нижче:

Зліва: Модель кульок і паличок для представлення структури простого неорганічного з'єднання. Праворуч: Представлення неорганічної сполуки, в якій додано часткове багатогранне представлення

Зліва: Анімована модель паличок для представлення упаковки та молекулярної структури простої органічної сполуки. Праворуч: Враховуючи складність біологічних молекул, моделі, які їх представляють, зазвичай прості, показуючи загальну складку та різні структурні мотиви (α-спіралі, β-нитки, петлі тощо), показані за допомогою стрічкової моделі. У прикладі також показано представлення палички кофактора, пов'язаного з ферментом.

Зліва: Комбінована модель стрічок і паличок для представлення димерної структури білка, який також показує сульфатний іон посередині - представлений кульками Праворуч: Представлення поверхні біологічної молекули, де кольори представляють різні властивості гідрофобії. Стрілка являє собою диполярний імпульс молекули.

Нарешті, використовуючи додаткову інформацію з інших методів (таких як кріо-електронна мікроскопія) або поєднання двох різних кристалічних конформацій молекули, доступні інші моделі, як показано нижче. Більш того, використовуючи ультракороткі терміни експозиції рентгенівських променів, вироблених лазерами на вільних електронах (European XFEL), кристалографи здатні збирати дані дифракції макромолекул в різних конформаціях, тобто під час виконання своїх відповідних завдань. Таким чином, використовуючи величезну кількість рентгенівських знімків, ми можемо виробляти як плівку, де ми можемо стежити за молекулярними модифікаціями і, отже, розуміти їх функцію.

Зліва: Комбінована модель молекулярної структури білка та оболонки (отриманої за допомогою електронної мікроскопії з високою роздільною здатністю), що показує пору, утворену асоціацією чотирьох білкових молекул Праворуч: Спрощена анімована модель, що показує кісткове згортання фермент і структурні зміни між двома молекулярними станами: активним (відкритим) і неактивним (закритим). Структури обох станів визначалися кристалографією