1.7: Структурна резолюція

У контексті цієї глави вам також буде запропоновано відвідати ці розділи...

• Методи кристалізації білків
• Кристалічна симетрія та дифракційна симетрія
• Умови систематичних прогулів
• Функція Паттерсона і метод Паттерсона
• аномальна дисперсія

У попередніх розділах ми бачили, як рентгенівські промені взаємодіють з періодично структурованою речовиною (кристалами), і неявне питання, яке ми підняли з цих попередніх глав, таке:

Чи можемо ми «побачити» внутрішню будову кристалів? , або іншими словами,

Чи можемо ми «побачити» атоми і молекули, які будують кристали?

Відповідь, безумовно, так!

Зліва: Молекулярна структура пневмококового поверхневого ферменту

Центр: Молекулярна упаковка в кристалі простої органічної сполуки, показуючи її кристалографічну одиничну клітинку

Праворуч: Геометричні деталі, що показують кілька молекулярних взаємодій у фрагменті молекулярної структури білка

Як демонструють наведені вище приклади, кристалографія може показати нам структури дуже великих і складних молекулярних структур (лівий малюнок) і те, як молекули упаковуються разом у кристалічну структуру (центральна фігура). Ми також можемо побачити кожну геометричну деталь, а також різні типи взаємодій між молекулами або їх частинами (правильна фігура).

Однак для кращого розуміння основ, на яких базується ця відповідь, необхідно ввести деякі нові поняття або оновити деякі з раніше побачених...

---

У попередніх розділах ми бачили, що кристали представляють організовану та впорядковану речовину, що складається з асоціацій атомів та/або молекул, відповідних природному її стану з мінімумом енергії.

Ми також знаємо, що кристали можна описати повторюваними одиницями в трьох напрямках простору, і що цей простір відомий як прямий або реальний простір. Ці повторювані одиниці відомі як одиничні клітини (які також служать еталонною системою для опису атомних позицій). Це прямий або реальний простір, те саме, в якому ми живемо, можна описати електронною щільністю, ρ (xyz), функцією, визначеною в кожній точці одиничної комірки координат (xyz), де, крім того, діють елементи симетрії, які повторюють атоми і молекули всередині клітини.

Одиниця комірки (ліворуч), тривимірне укладання якої будує кристал (праворуч)

Мотиви (атоми, іони або молекули) повторюються операторами симетрії всередині одиничної клітини.

Осередки блоку укладаються в трьох вимірах, дотримуючись правил решітки, вибудовуючи кристал.

Ми також дізналися, що рентгенівські промені взаємодіють з електронами атомів у кристалах, в результаті чого утворюється дифракційна картина, також відома як зворотний простір, з властивостями решітки ( зворотна решітка) з певною симетрією, і де ми також можемо визначити повторювану клітинку (зворотну клітинку). «Точки» цієї зворотної решітки містять інформацію про інтенсивність дифракції.

Зліва: Взаємодія між двома хвилями, розсіяними електронами. Отримані хвилі показують ділянки темряви (руйнівної інтерференції), в залежності від розглянутого кута. Зображення спочатку взято з physics-animations.com.

Праворуч: Одне з сотень дифракційних зображень кристала білка. Чорні плями на зображенні є результатом кооперативного розсіювання (дифракції) від електронів всіх атомів, що містяться в кристалі.

За допомогою цього кооперативного розсіювання (дифракції) розсіяні хвилі взаємодіють один з одним, виробляючи єдиний дифрагований промінь у кожному напрямку простору, так що, залежно від різниці фаз (просування або затримки) серед окремих розсіяних хвиль, вони додають або відніміть, як показано на двох малюнках нижче:

Інтерференція двох хвиль з однаковою амплітудою і частотою (анімація взята з Університету штату Пенсільванія)

Композиція з двох розсіяних хвиль. A = результуюча амплітуда; I = результуюча інтенсивність (~ A ²)

(а) повністю у фазі (загальний ефект - сума обох хвиль)

(б) з певною різницею фази (вони додають, але не повністю)

(c) поза фазою (результуюча амплітуда дорівнює нулю)

Між двома згаданими просторами (прямим і взаємним) існує цілісний зв'язок (кожна деталь одного з просторів впливає на весь інший, і порок навпаки). Математично кажучи, цей зв'язок є перетворенням Фур'є, яке не може бути безпосередньо вирішено, оскільки дифракційний експеримент не дозволяє нам знати одну з фундаментальних величин рівняння, відносні фази (Φ) дифракційних пучків.

Зліва: цілісний зв'язок між прямим простором (ліворуч) та взаємним простором (праворуч). Кожна деталь прямого простору (зліва) залежить від загальної інформації, що міститься у відповідному просторі (праворуч), і навпаки... Кожна деталь відповідного простору (праворуч) залежить від загальної інформації, що міститься в прямому просторі (зліва).

Праворуч: Графічне зображення позафазового між двома хвилями. Відносна фаза між хвилями

Діаграма нижче за допомогою наступного пункту підсумовує, що означає дозвіл кристалічної структури за допомогою рентгенівської дифракції...

Атоми, іони та молекули упаковані в одиниці (елементарні клітини), які складаються в трьох вимірах, утворюючи кристал у просторі, який ми називаємо прямим або реальним простором. Дифракційні ефекти кристала можна представити у вигляді точок гратчастого математичного простору, який ми називаємо зворотною решіткою. Дифракційні інтенсивності, тобто почорніння цих точок зворотної решітки, представляють модулі деяких фундаментальних векторних величин, які ми називаємо структурними факторами. Якщо ми дізнаємося не тільки модулі цих векторів (інтенсивності), але і їх відносні орієнтації (тобто їх відносні фази), ми зможемо отримати значення функції електронної густини в кожній точці елементарної комірки, забезпечуючи таким чином положення атомів, що складають кристал.

Окреслення основних кристалографічних понять: прямий і взаємний простори. Питання полягає в отриманні інформації з лівого боку (прямого простору) з дифракційного експерименту (зворотний простір).

ЕЛЕКТРОННА ЩІЛЬНІСТЬ

Для того, щоб знати (або побачити) внутрішню структуру кристала, ми повинні вирішити математичну функцію, відому як «електронна щільність»; функція, яка визначається в кожній точці одиничної комірки (основне поняття кристалічної структури, введене в іншому розділі).

Функція електронної щільності, представлена літерою ρ, повинна бути розв'язана в кожній точці одиничної комірки, заданої координатами (x, y, z), відносяться до осях осередків одиниці. У тих точках, де ця функція приймає максимальні значення (оцінюються в перерахунку на електрони на кубічний Ангстрем) знаходиться там, де розташовані атоми. Це означає, що якщо ми зможемо обчислити цю функцію, ми «побачимо» атомну структуру кристала.

Формула-1. Функція, що визначає електронну густину в точці одиничної комірки, заданої координатами (x, y, z)

• F (hkl) являє собою результуючі дифракційні пучки всіх атомів, що містяться в одиничній комірці в заданому напрямку. Ці величини (насправді хвилі), по одній для кожного дифрагованого променя, відомі як структурні фактори. Їх модулі безпосередньо пов'язані з дифракційною інтенсивністю.

• h, k, l - індекси Міллера дифракційних пучків (зворотні точки) і Φ (hkl) представляють фази структурних факторів. V являє собою обсяг одиничної осередку. Функція має обмеження через те, наскільки спостерігається дифракційна картина. Кількість спостережуваних структурних факторів є кінцевим, і тому синтез буде лише приблизним і може показати деякі ефекти усічення.

Зліва: Поява зони карти електронної густини кристала білка перед її інтерпретацією.

Праворуч: Та сама карта електронної густини після її інтерпретації з точки зору пептидного фрагмента.

Рівняння вище (Формула 1) являє собою перетворення Фур'є між дійсним або прямим простором (де атоми, представлені функцією ρ ) і зворотний простір (рентгенівський малюнок), представлений амплітудами структурного фактора і їх фазами. Формула 1 також показує цілісний характер дифракції, оскільки для обчислення значення електронної густини в одній точці координат (xyz) необхідно використовувати внески всіх структурних факторів, що утворюються дифракцією кристалів.

Структурні фактори F (hkl) - це хвилі і тому можуть бути представлені у вигляді векторів за їх амплітудами, [F (hkl)] та фазами Φ (hkl) вимірюється на загальному походженні фаз.

Коли одинична комірка центросиметрична, для кожного атома за координатами (xyz) існує ідентична, розташована за адресою (-x, -y, -z). З цього випливає, що закон Фриделя тримає F (h, k, l) = F (-h, -k, -l) і вираження електронної щільності (Формула 1) спрощується, ставши Формулою 1.1. І фази структурних факторів також спрощуються, стаючи 0° або 180°...

Формула 1.1. Функція електронної густини в точці координат (x, y, z) у центросиметричній одиничній комірці.

Важливо усвідомлювати, що кількість і якість інформації, що надається функцією електронної щільності, ρ, дуже залежить від кількості і якості даних, використовуваних у формулі: структурні фактори F ( hkl) (амплітуди і фази!). Пізніше ми побачимо, що амплітуди структурних факторів безпосередньо отримані в результаті дифракційного експерименту.

Якщо у вашому браузері включена Java, в якості практичного вправи на перетворення Фур'є рекомендуємо відвідати наступні посилання:

• аплет Штеффен Вебер...

• або, ще краще, аплет Java люб'язно надано Ніколасом Шені y Жерве Чапуї (École Polytechnique Fédérale de Lausanne, Швейцарія), який ви можете завантажити (безкоштовно будь-якого вірусу) за посиланням показано і виконати самостійно комп'ютер. Цей аплет обчислює перетворення Фур'є двовимірної функції щільності ρ (x), що дає комплексну величину G (S), зворотний простір. Аплет також здатний обчислити обернене перетворення Фур'є G (S). Функція щільності може бути як періодичної, так і неперіодичної. Численні інструменти, включаючи інструменти для малювання, можуть бути застосовані для того, щоб зрозуміти роль амплітуд і фаз, які мають особливе значення в дифракційних явищах. Як ілюстрація може бути змодельована функція Паттерсона періодичної структури.

Аналітичний вираз структурних факторів, F (hkl), є простим і включає нову величину (ƒ _j), яка називається атомним коефіцієнтом розсіювання ( визначена в попередньому розділі), яка враховує різні сили розсіювання, з якими електрони атомів j розсіюють рентгенівські промені:

Формула-2. Структурний коефіцієнт для кожного дифракційного пучка. Це рівняння є перетворенням Фур'є електронної густини (Формула 1).

Вираз враховує коефіцієнти розсіювання ƒ всіх атомів j, що містяться в кристалічній одиничній комірці.

З експериментальної точки зору порівняно просто виміряти амплітуди [F (hkl)] всіх дифракційних хвиль, що виробляються кристалом. Нам просто потрібно джерело рентгенівського випромінювання, монокристал досліджуваного матеріалу і відповідний детектор. При виконанні цих умов ми можемо потім виміряти інтенсивності I (hkl) дифрагованих пучків з точки зору:

Формула-3. Зв'язок між амплітудою структурних факторів |F (hkl) | та їх інтенсивністю I (hkl)

K - коефіцієнт, який ставить експериментальні структурні фактори (F _rel), виміряні у відносній шкалі (яка залежить від потужності джерела рентгенівського випромінювання, розміру кристалів тощо) в абсолютну шкалу, яка полягає в скажімо, шкала обчислюваних (теоретичних) структурних факторів (якби ми могли дізнатися їх з реальної структури, Формула 2 вище). Оскільки структура на даному етапі невідома, цей фактор можна приблизно оцінити за допомогою експериментальних даних за допомогою так званого графіка Вільсона.

Ділянка Вільсона

I _rel представляє середню інтенсивність (у відносній шкалі), зібрану в заданому інтервалі θ (кут Брегга); f _{j -} коефіцієнти атомного розсіяння в цей кутовий діапазон, а λ - довжина хвилі рентгенівського випромінювання.

Шляхом побудови величин, показаних на лівому малюнку (зелені точки), виходить пряма лінія, з якої можна отримати наступну інформацію:

• Значення перехоплення осі y - це логарифм Naperian C, величина, пов'язана з масштабним коефіцієнтом K (= 1/√ C), описаним вище.
• Нахил еквівалентний -2B, де B - ізотропний загальний атомний коефіцієнт теплової вібрації.

А - коефіцієнт поглинання, який можна оцінити за розмірами і складом кристала.

L відомий як фактор Лоренца, відповідальний за корекцію різних кутових швидкостей, з якими зворотні точки перетинають поверхню сфери Евальда. Для кутометрів з чотирма кругами цей коефіцієнт можна обчислити як 1/sin 2θ , де θ - кут Брегга відбиття.

p - коефіцієнт поляризації, який коригує ефект поляризації падаючого пучка, і задається виразом (1+cos ² 2θ) /2, де θ також представляє кут Брегга роздуми (зворотні точки).

ФАЗОВА ПРОБЛЕМА

Однак для того, щоб обчислити електронну щільність (ρ (xyz) у Формулі 1, вище), а отже, щоб знати атомні положення всередині одиничної комірки, ми також потрібно знати фази різних дифракційних пучків (Φ (hkl) у Формулі 1 вище). Але, на жаль, ця цінна інформація втрачається під час дифракційного експерименту (немає експериментальної методики вимірювання фаз!) Таким чином, ми повинні зіткнутися з так званою фазовою проблемою, якщо хочемо вирішити Формулу 1.

Фазову проблему можна дуже легко зрозуміти, якщо порівняти дифракційний експеримент (як процедуру, щоб побачити внутрішню структуру кристалів) зі звичайним оптичним мікроскопом...

Ілюстрація на фазовій задачі. Порівняння оптичного мікроскопа та «неможливого» рентгенівського мікроскопа. Немає оптичних лінз, здатних поєднувати дифракційні рентгенівські промені для отримання збільшеного зображення вмісту кристалів (атомів і молекул).

У звичайному оптичному мікроскопі видиме світло висвітлює зразок, а розсіяні промені можна рекомбінувати (з інтенсивністю і фазою) за допомогою системи лінз, що призводить до збільшення зображення спостережуваного зразка.

У тому, що ми могли б назвати неможливим рентгенівським мікроскопом (процес перегляду всередині кристалів для визначення атомних позицій), видиме світло замінюється рентгенівськими променями (з довжинами хвиль, близькими до 1 Ангстрема) та зразком (кристал) також розсіює цей «світло» (рентгенівські промені). Однак у нас немає жодної системи лінз, яка могла б грати роль оптичних лінз, щоб рекомбінувати дифракційні хвилі, забезпечуючи нам пряму «картину» внутрішньої структури кристала. Експеримент рентгенівської дифракції якраз дає нам зображення зворотної решітки кристала на фотопластині або детекторі. Єдине, що ми можемо зробити на цьому етапі - виміряти положення і інтенсивність плям, зібраних на детекторі. Ці інтенсивності пропорційні амплітудам структурного фактора, [F (hkl)].

А ось щодо фаз, Φ (hkl), на даний момент нічого не можна зробити, що заважає отримати прямий розв'язок функції електронної густини (Формула 1 вище).

Тому нам потрібні деякі альтернативи для того, щоб отримати значення фази, втрачені під час дифракційного експерименту...

СТРУКТУРНА РЕЗОЛЮЦІЯ

Після того, як фазова проблема відома та зрозуміла, давайте тепер подивимося загальні кроки (див. Схему нижче), з якими повинен зіткнутися кристалограф, щоб вирішити структуру кристала і, отже, знайти положення атомів, іони або молекули, що містяться в одиничній клітині...

Загальна діаграма, що ілюструє процес роздільної здатності молекулярних і кристалічних структур за допомогою рентгенівської дифракції Процес складається з різних етапів, які були оброблені раніше або описані нижче:

• Отримання кристала, придатного для експерименту, з адекватною якістю і розміром. Щось пов'язане буде видно в іншому розділі.
• Отримання дифракційної картини з відповідною довжиною хвилі. Це було описано в іншому розділі.
• Оцінка дифракційної картини для отримання параметрів решітки (одинична комірка), симетрії (просторова група) та інтенсивності дифракції.
• Розв'язування функції електронної густини, отримання будь-якої інформації про фазах дифрагованих пучків. Це ключовий момент для структурної резолюції, про який піде мова нижче.
• Побудова початкової структурної моделі для пояснення значень функції електронної густини та завершення моделі розміщення інших атомних позицій. Це буде видно нижче.
• Уточнення моделі, коригування всіх атомних позицій, щоб отримати розрахункову дифракційну картину, максимально подібну до експериментальної дифракційної картини, і, нарешті, перевірити та показати загальну отриману структурну модель. Це буде видно в іншому розділі.

Щоб дослідження було успішним, необхідно враховувати деякі важливі аспекти, такі як:

• Досліджуване з'єднання повинно бути чистим для кристалізації (якщо ще немає, як у випадку з природними мінералами).

• Кристали можна отримати за допомогою різних методів, від найпростішого методу випаровування або повільного охолодження до більш складного: дифузії пари (або розчинника), сублімації, конвекції тощо. Дивіться, наприклад, сторінки LEC, Лабораторії кристалографічних досліджень, для отримання додаткової інформації про конкретні методи кристалізації. Для білків найбільш широко використовувана процедура заснована на експериментах з дифузією пари, як правило, з технікою «висячої краплі», описаної в інших місцях на цих сторінках. У цьому сенсі дуже актуально відзначити останні досягнення, впроваджені в області фемтосекундної рентгенівської нанокристаллографії білка, що означатиме гігантський крок для практично усунення більшості труднощів в процесі кристалізації, і зокрема для білків (див. абзац, присвячений рентгенівському лазеру на вільному електроні).

• Якщо отримані відповідні кристали, вони піддаються впливу рентгенівських променів та їх дифракційних інтенсивностей, виміряних за допомогою методів та обладнання, описаних у попередньому розділі. Ретельна оцінка даних надасть нам розміри одиничної клітини, симетрію та, безпосередньо від інтенсивностей, амплітуди структурних факторів [F (hkl)]. З усіх цих предметів на даному етапі найскладніший стосується визначення кристалічної симетрії, ключового питання для успішного вирішення структури. Для отримання кристалічної симетрії візуальне дослідження кристала б не мало сенсу, і тому його потрібно виводити з симетрії дифракційної картини, як зазначено в конкретному розділі цих сторінок.

• На цьому етапі виникає питання про невідомих фазах, Φ (hkl), так що їх потрібно якось оцінювати, як ми побачимо нижче...

• Якщо оцінені фази правильні, функція електронної густини ρ (xyz) покаже розподіл максимумів (атомних позицій) послідовних і значущих зі стереохімічної точки зору. Після того, як буде відома початкова структура, необхідно провести деякі додаткові етапи (побудова детальної моделі, математичне уточнення та валідація). Це призведе нас до так званої кінцевої моделі конструкції.

Але повернемося до найважливішого питання: як ми вирішуємо фазову задачу?

ФУНКЦІЯ ПАТТЕРСОНА

Найперше рішення фазової задачі ввів Артур Ліндо Паттерсон (1902-1966).

Грунтуючись на нездатності безпосередньо розв'язати функцію електронної густини (Формула 1 вище або нижче), а після навчання (під керівництвом американського математика Норберта Вінера) на згортці перетворення Фур'є Паттерсон ввів нову функцію P ( uvw) (Формула 4, нижче) в 1934 році. Цю формулу, яка визначає новий простір (простір Паттерсона), можна розглядати як найважливішу подію в аналізі кристалічної структури з моменту відкриття Рентгеном рентгенівських променів у 1895 році або рентгенівського випромінювання дифракція Лауе в 1914 році.

Його елегантна формула, відома як функція Паттерсона (Формула 4, нижче), вводить спрощення інформації, що міститься в функції електронної щільності. Функція Паттерсона видаляє термін, що містить фази, а амплітуди структурних факторів замінюються їх квадратами. Таким чином, це функція, яка може бути розрахована відразу з наявних експериментальних даних (інтенсивності, які пов'язані з амплітудами структурних факторів). Формально з математичної точки зору функція Паттерсона еквівалентна згортці електронної густини (Формула 1, нижче) з її оберненою: ρ (x, y, z) * ρ (-x, -y, -z).

Формула-1. Функція електронної густини обчислюється в точці координат (x, y, z).

Формула 4. Функція Паттерсона обчислюється в точці (u, v, w) . Це спрощення Формули 1 , так як підсумовування проводиться по F ² (hkl) і всі фази приймаються рівними нулю.

Здається очевидним, що після пропуску важливої інформації, що міститься у фазах [Φ (hkl) у Формулі 1], функція Паттерсона більше не буде показувати прямі позиції атомів в одиничній комірці, як функція електронної щільності Насправді функція Паттерсона забезпечує лише карту міжатомних векторів (відносних атомних позицій), висота її максимумів пропорційна кількості електронів атомів, що мається на увазі. Ми побачимо, що ця особливість означає перевагу у виявленні положень «важких» атомів (з багатьма електронами) у структурах, де решта атомів мають менші атомні номери. Після обчислення карти Паттерсона її потрібно правильно інтерпретувати (принаймні частково), щоб отримати абсолютні позиції (x, y, z) важких атомів у одиничній клітині. Ці атомні позиції тепер можуть бути використані для отримання фаз Φ (hkl) дифрагованих пучків шляхом інвертування Формули 1, і тому це дозволить обчислити функцію електронної щільності ρ (xyz), але це буде об'єкт іншого розділу цих сторінок.

ПРЯМІ МЕТОДИ

Фазову задачу для кристалів, утворених молекулами малого та середнього розміру, задовільно вирішували кілька авторів протягом ХХ століття з особливою згадкою Джерома Карле (1918-2013) та Герберта Гауптмана. (1917-2011), який розділив Нобелівську премію з хімії в 1985 році (не забуваючи про роль Ізабелли Карле, 1921-2017). Методологія, введена цими авторами, відома як прямі методи, зазвичай використовує обмеження або статистичні кореляції між фазами різних компонентів Фур'є.

Зліва: Герберт Гауптман (1917-2011)

Центр: Джером Карле (1918-2013)

Праворуч: Ізабелла Карле (1921-2017)

Атомічність молекул, і той факт, що функція електронної щільності повинна бути нульовою або позитивною в будь-якій точці одиничної клітини, створює певні обмеження в розподілі фаз, пов'язаних зі структурою факторів. У цьому контексті прямі методи встановлюють системи рівнянь, які використовують інтенсивності дифрагованих пучків для опису цих обмежень. Дозвіл цих систем рівнянь дає пряму інформацію про розподіл фаз. Однак оскільки достовірність кожного з цих рівнянь встановлюється з точки зору ймовірності, необхідно мати велику кількість рівнянь для завищення значень фаз невідомих (фаз Φ (hkl)).

Прямі методи використовують рівняння, які пов'язують фазу відбиття (hkl) з фазами інших сусідських відображень (h', k', l' y h', k-k ', l-l'), припускаючи, що ці відносини "ймовірно істинні" (P )...

де E _hkl, E _{h'k'l '}і E _{h-h', k-k ', l-l'} - це так звані «нормовані структурні фактори», тобто структурні фактори, скориговані на тепловий рух, доведені до абсолютного масштаб і припускаючи, що структури складаються з точкових атомів. Іншими словами, нормалізація структурного фактора перетворює виміряні значення |F | в коефіцієнти «точкових атомів у спокої», відомі як значення |E |.

В даний час прямі методи є кращими для фазування структурних факторів, що виробляються малими або середніми молекулами, що мають до 100 атомів в асиметричній одиниці. Однак вони, як правило, не можливі самі по собі для більших молекул, таких як білки. Зацікавлений читач повинен подивитися на відмінне вступ до прямих методів через це посилання, запропоноване Міжнародним союзом кристалографії.

МЕТОДИ СТРУКТУРНОЇ РОЗВ'ЯЗКИ МАКРОМОЛЕКУЛ

Для кристалів, що складаються з великих молекул, таких як білки та ферменти, фазова проблема може бути успішно вирішена трьома основними методами, залежно від випадку:

(i) введення атомів в структуру з високою потужністю розсіювання. Ця методологія, відома як MIR (множинна ізоморфна заміна), тому базується на методі Паттерсона.

(ii) введення атомів, які аномально розсіюють рентгенівські промені, також відомі як MAD (багатохвильова аномальна дифракція), і

(iii) за допомогою методу, відомого як MR (молекулярна заміна), який використовує раніше відому структуру подібного білка.

MIR (MI множинна I одноморфна заміна R)

Ця методика, заснована на методі Паттерсона, була введена Девідом Харкером, але вперше була успішно застосована Максом Ф.Перутцем і Джоном Кендрю, які отримали Нобелівську премію в Хімія в 1962 році, для вирішення найпершої структури білка, гемоглобіну.

Зліва: Девід Харкер (1906-1991)

Центр: Макс Фердинанд Перутц (1914-2002)

Праворуч: Джон Каудері Кендрю (1917-1997)

Метод MIR застосовується після введення в кристалічну структуру «важких» атомів (великих розсіювачів). Однак складність цієї методики полягає в тому, що важкі атоми не повинні впливати на кристалоутворення або одиничні розміри клітини в порівнянні з її рідною формою, отже, вони повинні бути ізоморфними.

Цей метод проводиться шляхом замочування кристала проаналізованого зразка важким атомним розчином або шляхом спільної кристалізації з важким атомом, в надії, що важкі атоми йдуть по каналах кристалічної структури і залишаються пов'язаними з амінокислотними бічними ланцюгами зі здатністю координувати атоми металів (наприклад, групи SH цистеїну). У випадку металопротеїнів їх ендогенні метали можна замінити більш важкими (наприклад, Zn на Hg, Ca на Sm тощо).

Важкі атоми (з великою кількістю електронів) показують більш високу силу розсіювання, ніж нормальні атоми білка (C, H, N, O і S), і тому вони помітно змінюють інтенсивності дифракційної картини при порівнянні з нативним білком. Ці відмінності в інтенсивності між двома спектрами (важкими і нативними структурами) використовуються для обчислення карти міжатомних векторів між положеннями важких атомів (карта Паттерсона), з якої відносно легко визначити їх координати всередині одиничної комірки.

Схема функції Паттерсона, отриманої з кристала, що містить три атоми в одиничній клітині. Для отримання цієї функції графічно з відомої кристалічної структури (лівий малюнок) побудовані всі можливі міжатомні вектори (центральна фігура). Потім ці вектори переміщуються паралельно собі до початку одиничної клітинки Паттерсона (права фігура). Обчислена функція покаже максимальні значення в кінці цих векторів, висоти яких пропорційні добутку атомних номерів задіяних атомів. Позиції на цих максимумах (з координатами u, v, w) представляють відмінності між координатами кожної пари атомів у кристалі, тобто u=x ₁ -x ₂, v=y ₁ -у ₂, ш = з ₁ -з ₂.

При відомих положеннях важких атомів структурні фактори тепер обчислюються за формулою 2 (див. Також діаграму нижче), тобто їх амплітуди |F _c (hkl) | і фази Φ _c (hkl), де індекс c означає «обчислений». Використовуючи формулу 1, карта щільності електронів, ρ (xyz) тепер обчислюється з використанням амплітуд структурних факторів, що спостерігаються в експерименті, |F _o (hkl) | (містять внесок всієї структури) суміщений з розрахунковими фазами Φ _c (hkl). Якщо ці фази досить хороші, розрахована карта електронної щільності покаже не тільки відомі важкі атоми, але і дасть додаткову інформацію про подальші атомні позиції (див. Діаграму нижче).

Підсумовуючи, кроки методології MIR:

• Підготуйте один або кілька важких похідних атомів, які повинні бути ізоморфними з нативним білком. Перший тест ізоморфізму проводиться з точки зору одиничних параметрів клітини.

• Збирайте дані про дифракцію як з похідних, так і з важких атомів.

• Застосовуйте метод Паттерсона, щоб отримати важкі позиції атома.

• Уточніть ці атомні позиції та обчисліть фази для всіх дифрагованих пучків.

• Отримати карту щільності електронів з цими розрахунковими фазами.

MAD (M багатохвильова змінна частота змінного струму)

Зміни інтенсивності даних дифракції, що виникають при введенні важких атомів у кристали білка, можна розглядати як хімічну модифікацію дифракційного експерименту. Аналогічно, ми можемо викликати зміни інтенсивності дифракції шляхом модифікації фізичних властивостей атомів. Таким чином, якщо падаюче рентгенівське випромінювання має частоту, близьку до частоти власних коливань електронів в даному атомі, атом поводиться як «аномальний розсіювач». Це призводить до деяких змін в атомному коефіцієнті розсіювання, ƒ _j (див. Формула 2), так що його вираз модифікується двома членами, ƒ' і ƒ» які враховують її реальну і уявну складові відповідно. Для атомів, які поводяться аномально, його коефіцієнт розсіювання задається виразом, показаним нижче (Формула 5).

Формула 5. При наявності аномального розсіювання коефіцієнт атомного розсіювання, ƒ ₀ , повинен бути змінений, додавши два нових члени, дійсну і уявну частину.

Просунутий читач також повинен прочитати розділ про явище аномальної дисперсії.

Поправки «і ƒ» проти рентгенівської енергії (див. Нижче для випадку Cu Kα) можуть бути розраховані з урахуванням деяких теоретичних міркувань...

Реальна та уявна складові коефіцієнта розсіювання селену проти енергії падаючих рентгенівських променів. Вертикальна лінія вказує довжину хвилі для CUKα.

Для рентгенівських значень енергії, де існує резонанс, ƒ' різко зростає, тоді як значення ƒ» зменшується. Це має практичне значення, враховуючи, що багато важких атомів, що використовуються в кристалографії, показують піки поглинання при енергіях (довжині хвиль), які можна легко отримати за допомогою синхротронного випромінювання. Дані про дифракцію, зібрані в цих умовах, показуватимуть нормальний компонент, головним чином завдяки атомам світла (азот, вуглець та водень), і аномальну частину, що виробляється важкими атомами, що призведе до глобальної зміни фази кожного відображення. Все це призводить до зміни інтенсивності між тими відображеннями, відомими як пари Фриделя (пари відображень, які в нормальних умовах повинні мати однакові амплітуди та однакові фази, але з протилежними ознаками). Виявлена зміна інтенсивності між цими парами відображення (пари Фриделя) - це те, що ми називаємо аномальною дифракцією.

Метод MAD, розроблений Хендріксоном і Каном, передбачає вимірювання дифракційних даних кристалу білка (що містить сильний аномальний розсіювач) з використанням рентгенівських випромінювань з різною енергією (довжинами хвиль): той, який максимізує ƒ' ', інший, який мінімізує ƒ' та третє вимірювання при енергетичному значенні, відмінному від цих двох. Об'єднавши ці дифракційні набори даних, і конкретно аналізуючи відмінності між ними, можна обчислити розподіл амплітуд і фаз, породжених аномальними розсіювачами. Подальше використання фаз, що генеруються цими аномальними розсіювачами, в якості першого наближення може бути використано для обчислення карти електронної густини для всього білка.

Взагалі, немає поточної необхідності вводити окремі атоми як аномальні розсіювачі в білкових кристалах. Порівняно легко отримати рекомбінантні білки, в яких залишки метіоніну замінюються селен-метіоніном. Атоми селену (і навіть сірки) метіоніну (або цистеїну) поводяться як відповідні аномальні розсіювачі для проведення експерименту MAD.

Метод MAD представляє деякі переваги в порівнянні з методикою MIR:

• Оскільки техніка MAD використовує дані, зібрані з монокристалу, проблеми, отримані через відсутність ізоморфізму, поширеного в методі MIR, не застосовуються.

• У той час як за відсутності аномальної дисперсії коефіцієнт атомного розсіювання (ƒ ₀) різко зменшується з кутом дисперсії, його аномальною складовою (ƒ' + i ƒ») не залежить від цього кута, так що цей відносний сигнал збільшується при більш високій роздільній здатності спектру, тобто при високих кутах Брегга. Таким чином, оцінки фаз MAD, як правило, кращі при високій роздільній здатності. Навпаки, при методі MIR відсутність ізоморфізму більша при високих кутах роздільної здатності, і тому висока інтенсивність роздільної здатності (> 3,5 Ангстрема) не підходить для фазування.

Діаграма Арганда, що показує внесок розсіювання від аномального розсіювача в матриці нормальних розсіювачів. Цей ефект означає, що закон Фриделя провалюється. Зображення взято з «Кристалографії 101».

• Fp являє собою внесок від нормальних розсіювачів до структурного фактора (індексів hkl).
• Fa і Fa» представляють дійсну (ƒ ₀ + ƒ') і уявну (ƒ») частини, відповідно, коефіцієнта розсіювання від аномальних розсіювачів.
• -Fp, -Fa і -Fa» представляють те ж саме, що і Fp, Fa і Fa», але для відображення з індексами -h, -k, -l.

Аномальна поведінка атомного коефіцієнта розсіювання створює лише невеликі відмінності між інтенсивностями (і, отже, серед амплітуд структурних факторів) відбиття, які пов'язані центром симетрії або дзеркальною площиною (наприклад, I (h, k, l) проти. I (-h, -k, -l), або I (h, k, l) проти. I (ч, -к, л). Тому для оцінки цих невеликих відмінностей між експериментальними інтенсивностями необхідно враховувати додаткові запобіжні заходи. Таким чином, рекомендується, щоб відбиття, які, як очікується, показуватимуть ці відмінності, збиралися на одному і тому ж дифракційному зображенні або, як варіант, після кожного зібраного зображення повертати кристал на 180 градусів і збирати нове зображення. Більше того, оскільки зміни в ƒ' і ƒ» відбуваються мінімальними коливаннями енергії рентгенівського випромінювання, необхідно мати хороший контроль енергетичних значень (довжини хвиль). Тому важливо використовувати засіб синхронітронного випромінювання, де довжини хвиль можна легко налаштувати.

Просунутий читач також повинен заглянути в веб-сторінки з аномального розсіювання, підготовлені Бернхардом Руппом, а також практичне резюме, підготовлене Георгом Шелдріком.

MR (Молекулярна заміна R)

Якщо ми знаємо структурну модель білка з гомологічною послідовністю амінокислот, фазову проблему можна вирішити за допомогою методології, відомої як молекулярна заміна (МР). Відома структура гомологічного білка розглядається як білок, який потрібно визначити, і служить першою моделлю, яку слід згодом вдосконалити. Ця процедура, очевидно, заснована на спостереженні, що білки з подібними пептидними послідовностями показують дуже схожу складку. Проблема в даному випадку полягає в перенесенні молекулярної структури відомого білка з власної кристалічної структури на нову кристалічну упаковку білка з невідомою структурою. Позиціонування відомої молекули в одиничну клітину невідомого білка вимагає визначення її правильної орієнтації і положення всередині одиничної клітини. Обидві операції, обертання і переклад, обчислюються за допомогою так званих функцій обертання і перекладу (див. Нижче).

Схема методу молекулярного заміщення (МР).

Молекула з відомою структурою (А ) обертається через операцію [R] і зміщується через T, щоб привести її в положення невідомого молекула (A').

Функція обертання. Якщо розглядати випадок двох однакових молекул, орієнтованих по-різному, то функція Паттерсона буде містити три множини векторів. Перший з них буде містити вектори Паттерсона однієї з молекул, тобто всі міжатомні вектори всередині молекули один (також званий власними векторами). Другий набір міститиме ті ж вектори, але для другої молекули, ідентичні першій, але повернуті через їх різну орієнтацію. Третій набір векторів буде міжатомними поперечними векторами між двома молекулами. Поки власні вектори обмежені об'ємом, зайнятим молекулою, перехресні вектори будуть виходити за цю межу. Якщо обидві молекули (відомі та невідомі) дуже схожі за структурою, функція обертання R (α, β, γ) намагатиметься привести вектори Паттерсона однієї з молекул збігаються з векторами іншої, поки вони не будуть узгоджені. Цю методику вперше описали Россман і Блоу.

R (α, β, γ) = _u П ₁ (u) х Р ₂ (u _р) ду

Формула 6. Функція обертання

P ₁ - функція Паттерсона, а P ₂ - повернута функція Паттерсона, де u - об'єм карта Паттерсона, де обчислюються міжатомні вектори.

Якість розв'язків цих функцій виражається коефіцієнтом кореляції між обома функціями Паттерсона: експериментальною і розрахунковою (з відомим білком). Високий коефіцієнт кореляції між цими функціями еквівалентний хорошому узгодженню між експериментальною дифракційною схемою та дифракційною схемою, розрахованою з відомою структурою білка. Після того, як відома білкова структура правильно орієнтована та перекладена (всередині одиничної клітини невідомого білка), карта електронної щільності обчислюється з використанням цих атомних позицій та експериментальних структурних факторів. Варто проконсультуватися зі статтею, опублікованою за цією методикою Елеонорою Додсон.

Ймовірно, для просунутого читача цінно проконсультуватися з приємною статтею, яка, незважаючи на те, що була опублікована в 2010 році, не втратила своєї дійсності стосовно опису різних методологій визначення відносних фаз дифракційних пучків.

ЗАВЕРШЕННЯ СТРУКТУРИ

Всі ці методи (Паттерсон, прямі методи, MIR, MAD, MR) забезпечують (прямо чи опосередковано) знання про приблизні фази, які необхідно модернізувати. Як зазначалося вище, розраховані початкові фази, Φ _c (hkl) разом із спостережуваними експериментальними амплітудами, |F _o (hkl) |, дозволяють обчислити карту електронної щільності, також приблизну, на якій ми можемо побудувати структурну модель. Загальний процес узагальнено на циклічній діаграмі, наведеній нижче.

Початкові фази, Φ _c (hkl), поєднуються з амплітудами експериментальних (спостережуваних) структурних факторів, |F _o (hkl) |, і електроном розраховується карта щільності (показана внизу схеми). Крім того, якщо початковими відомими даними є координати (xyz) деяких атомів, вони забезпечать початкові фази (показані у верхній частині схеми) і так далі циклічним способом, поки процес не дасть ніякої нової інформації.

Схема, що показує циклічний процес обчислення карт щільності електронів ρ (xyz), які дають подальшу структурну інформацію.

З декількох відомих атомних позицій ми завжди можемо обчислити структурні фактори: їх амплітуди, |Fc (hkl) |, і їх фази, Φc (hkl), як показано у верхній частині схеми. Очевидно, що розраховані амплітуди можуть бути відхилені, оскільки вони обчислюються з часткової структури, а експериментальні представляють цілу і реальну структуру. Тому карта щільності електронів (показана внизу схеми) обчислюється з експериментальними (або спостережуваними) амплітудами |Fo (hkl) |, і розрахунковими фазами, Φc (hkl). Ця функція тепер оцінюється з точки зору можливих нових атомних позицій, які додаються до раніше відомих, і цикл повторюється. Історично цей процес був відомий як «послідовні синтези Фур'є», оскільки електронна щільність обчислюється через суму Фур'є.

У будь-якому випадку, з атомних позицій або безпосередньо з фаз, якщо інформація правильна, функція електронної щільності буде інтерпретована і буде містити додаткову інформацію (нові атомні координати), які можуть бути введені в циклічну процедуру, показану вище, до завершення структури, яка полягає в скажімо, поки обчислена функція ρ (xyz) не покаже ніяких змін від останнього обчислення.

Більш легкі атоми структури (ті, що мають менший атомний номер, тобто зазвичай атоми водню) найважче знайти на карті електронної щільності. Їх сила розсіювання майже затьмарюється розсіюванням інших атомів. З цієї причини розташування атомів H зазвичай здійснюється за допомогою дещо модифікованої функції електронної щільності (різницевої електронної щільності), коефіцієнти якої є відмінностями між спостережуваними та розрахованими структурними факторами моделі, відомої досі:

Формула 7. Функція «різниці» електронної щільності

На практиці, якщо отримана структурна модель досить хороша, якщо експеримент передбачив точні структурні фактори, і немає конкретних помилок, таких як поглинання рентгенівського випромінювання, карта різниці Δρ буде містити достатню кількість сигналу (максимумів), де атоми Н можуть бути розташовані. Крім того, щоб отримати посилений сигнал від розсіювання атомів світла, ця функція зазвичай обчислюється з факторами структури, що з'являються тільки при нижчих кутах дифракції, як правило, з тими, що з'являються при sin θ /λ < 0,4, тобто, використовуючи область, де Фактори розсіювання по водню все ще «видно».