1.6: Експериментальна дифракція
- Page ID
- 26100
У контексті цієї глави вам також буде запропоновано відвідати ці розділи...
Незалежно від величезних поліпшень, які відбулися для генерації рентгенівських променів, методи, що використовуються для вимірювання інтенсивності та кутів дифракційних моделей, розвивалися з часом. У першому дифракційному експерименті Фрідріх і Кніппінг (1912) використовували плівку, чутливу до рентгенівських променів, але навіть в тому ж році Брегг використовував іонізаційну камеру, встановлену на обертовому плечі, яка, загалом, могла б більш точно визначати кути і інтенсивності. Однак плівкова техніка мала перевагу в тому, що вона могла збирати багато дифракційних променів одночасно, і, таким чином, протягом перших років структурної кристалографії (з 1920 по 1970 рік) було широко використано фотографічні методи. Серед них слід виділити наступні прийоми: Лауе, Вайсенберг, прецесія і коливання.
З середини 1970-х років фотографічні методи поступово замінюються кутомірами в поєднанні з точковими детекторами, які згодом були замінені детекторами площі.
Метод Лауе
Для своїх перших експериментів Макс фон Лауе (1879-1960) (Нобелівська премія з фізики 1914 р.) використовував безперервне випромінювання (з усіма можливими довжинами хвиль) для впливу на стаціонарний кристал. За допомогою цієї процедури кристал генерує набір дифрагованих пучків, які показують внутрішню симетрію кристала. За цих обставин та з урахуванням Закону Брегга експериментальними константами є міжпланарний інтервал d та положення кристала, що посилається на падаючий промінь. Змінними є довжина хвилі λ і ціле число n:
n λ = 2 д hkl син θ нх, нк, нл
Таким чином, для одного і того ж міжплощинного інтервалу d дифракційна картина буде містити дифракційні пучки, що відповідають першому порядку дифракції (n =1) певної довжини хвилі, другого порядку ( n = 2) половини довжини хвилі (λ /2), третього порядку (n =3) з довжиною хвилі λ /3 і т.д. Тому діаграма Лауе - це просто стереографічна проекція кристала. Дивіться також моделювання Java, пропоноване за цим посиланням.
Діаграма Лауе кристала
У методі Лауе є дві різні геометрії, залежно від положення кристала щодо фотопластини: передача або відображення:
Зліва: Метод Лауе в режимі передачі
Праворуч: Метод Лауе в режимі відображення
метод Вайсенберга
Метод Вайсенберга заснований на однойменній камері, розробленої в 1924 році австрійським вченим Карлом Вайсенбергом (1893-1976). Для того, щоб зрозуміти внесок Вайсенберга в рентгенівську кристалографію, слід прочитати дві наступні статті, які кілька років тому були запропоновані Британському товариству реології: «Вплив Вайсенберга на кристалографію» (Г.Ліпсон) (використовуйте це посилання в випадок проблем) та «Карл Вайсенберг та розвиток рентгенівської кристалографії» (М.Дж. Бюргер).
Камера складається з металевого циліндра, який містить плівку, чутливу до рентгенівських променів. Кристал встановлений на валу (співвісний з циліндром), який обертається. Згідно з моделлю Евальда, зворотні точки будуть перетинати поверхню сфери Евальда і будуть вироблятися дифракційні пучки.
Дифракційні промені генерують чорні плями на фотоплівці, які при видаленні з металевого циліндра з'являються, як показано нижче.
Зліва: Схема та приклад камери Вайсенберга. Цей тип камери використовувався в кристалографічних лабораторіях приблизно до 1975 року.
Праворуч: Камера, розроблена К.Вайсенбергом у 1924 році
Два типи дифракційних діаграм можна легко отримати за допомогою камер Вайсенберга, залежно від величини обертання кристалів: діаграми коливань (обертання приблизно +/- 20 градусів) або діаграми повного обертання (360 градусів) відповідно. Діаграми коливань використовуються для центрування кристала, тобто для забезпечення того, щоб обертання осі точно збігалося з прямою віссю, що еквівалентно тому, що зворотні площини (які геометричною конструкцією перпендикулярні прямій осі) генерують лінії плям на фотоплівці. Як тільки центрування досягнуто, для оцінки прямої осі кристала використовуються повні діаграми обертання, яка збігається з інтервалом між точковими лініями на діаграмі.
Схема, що пояснює виготовлення діаграми Вайсенберга різновиди обертання або коливань. Коли зворотні точки, що належать одній і тій же зворотній площині, стикаються з поверхнею сфери Евальда, вони виробляють дифракційні пучки, розташовані в конусах.
Як показано на схемі вище, кожна горизонтальна лінія точок являє собою зворотну площину, перпендикулярну осі обертання, як проектується на фотопластині. На малюнку зліва зображений реальний вигляд діаграми Вайсенберга такого типу, обертання-коливання.
Як пояснюється нижче, відстань між горизонтальними лініями плями надає інформацію про період повторення кристалів у вертикальному напрямку плівки.
Ці діаграми також використовувалися для вирівнювання змонтованих кристалів... Ця методика вимагає, щоб вісь обертання кристала збігалася з віссю його прямої решітки, щоб зворотні площини збиралися у вигляді ліній плям, як показано зліва.
Кристал повинен бути змонтований таким чином, щоб вісь обертання збігалася з прямою віссю одиничної осі елемента. Таким чином, за визначенням зворотної решітки будуть зворотні площини, перпендикулярні цій осі. Зворотні точки (що лежать на цих взаємних площинам) обертаються при обертанні кристала і (пройшовши через сферу Евальда) виробляють дифракційні промені, які розташовані в конусах, стосуються циліндричної плівки і з'являються у вигляді вирівняних плям (фотографія зліва).
Здається очевидним, що ці діаграми відразу дають інформацію про період повторення прямої решітки в напрямку, перпендикулярному горизонтальним лініям (зворотним площинам). Однак ці взаємні площини (двовимірні масиви зворотних точок) представлені у вигляді проекцій (один вимір) на плівці, і тому слід очікувати сильного перекриття плям.
Проблема з точковим перекриттям була вирішена Вайсенбергом шляхом додавання механізму трансляції в камеру таким чином, щоб циліндр, що містить плівку, міг переміщатися в режимі «назад і вперед» (в напрямку, паралельному осі обертання) в поєднанні з обертанням кристала. При цьому він ввів два внутрішніх циліндра (як показано на лівому малюнку, а також нижче). Таким чином, лише один із дифрагованих конусів (ті, що мають зворотний шар), «фільтрується» і тому дозволяє досягти фотоплівки. Таким чином, одна зворотна площина (2-вимірний масив зворотних точок) розподіляється на поверхні плівки (два розміри) і тому ефект перекриття уникається.
Однак, як наслідок зворотного і зворотного трансляції камери при обертанні кристала, виникає деформація при розподілі плям (інтенсивності дифракції)
Поява такої схеми, яка виробляє геометричну деформацію зібраної зворотної площини, показано нижче. Беручи до уваги цю деформацію, можна легко виявити кожну пляму обраної зворотної площини і виміряти її інтенсивність. Для вибору інших зворотних площин потрібно просто зрушити внутрішні циліндри і зібрати відповідні їм дифракційні балки (розташовані в конусах).
Зліва: Деталі камери Вайсенберга, використовуваної для збору конуса дифрагованих променів. Два внутрішніх циліндра, що показують щілину, через яку конусу дифрагованих променів дозволено дістатися до фотоплівки. Зовнішній циліндр, що містить плівку, рухається вперед-назад, поки кристал обертається, і тому плями, які в попередньому типі діаграми були в лінії (див. Вище), тепер розподіляються на поверхні плівки (див. Малюнок праворуч).
Праворуч: діаграма Вайсенберга, що показує зворотну площину індексів hk2 метаборату міді.
метод прецесії
Метод прецесії був розроблений Мартіном Дж. Бюргером (1903-1986) на початку 1940-х років як дуже розумна альтернатива для збору дифракційних інтенсивностей без спотворення геометрії зворотних площин.
Як і в техніці Вайсенберга, методологія прецесії також базується на рухомому кристалі, але тут кристал рухається (а також пов'язана зворотна решітка), як це роблять планети, і звідси і його назва. При цьому плівка поміщається на плоску касету, яка рухається слідом за рухами кристалів.
У методі прецесії кристал повинен бути орієнтований так, щоб зворотна площина, яку потрібно збирати, перпендикулярна прямому пучку рентгенівських променів, тобто пряма вісь збігалася з напрямком падаючих рентгенівських променів.
Два схематичних вигляду, що показують принцип, на якому заснована камера прецесії. μ - кут прецесії, навколо якого рухається зворотна площина і фотоплівка. Під час цього руху зворотна площина і плівка завжди тримаються паралельно.
Призначена для цієї мети камера і поява діаграми прецесії, що показує дифракційну картину неорганічного кристала, показані на малюнках нижче.
Зліва: Схема і зовнішній вигляд прецесійної камери
Праворуч: Діаграма прецесії перовскіта, що показує кубічну симетрію
Діаграми прецесії набагато простіше інтерпретувати, ніж діаграми Вайсенберга, оскільки вони показують взаємні площини без будь-яких спотворень. Вони показують єдину зворотну площину на фотопластині (малюнок вище), коли кругла щілина поміщена між кристалом і фотоплівкою. Як і у випадку діаграм Вайсенберга, ми можемо легко вимірювати відстані та інтенсивність дифракції. Однак за допомогою цих діаграм набагато простіше спостерігати симетрію взаємного простору.
Єдиним недоліком прецесійного методу є наслідок плівки, яка є плоскою замість циліндричної, а тому досліджуваний суцільний кут менше, ніж у випадку Вайсенберга.
Метод прецесії успішно застосовується протягом багатьох років навіть для білкових кристалів:
Зліва: Діаграма прецесії кристала лізоциму. Можна легко відрізнити чотирикратну вісь симетрії, перпендикулярну діаграмі. За залежностями між прямими і взаємними гратами, якщо осі одиничної осередку великі (як в даному випадку), поділ між взаємними точками невелике.
Праворуч: Діаграма прецесії простої органічної сполуки, що показує мм симетрію (дві дзеркальні площини, перпендикулярні діаграмі). Зверніть увагу, що відстані між зворотними точками набагато більше (менші прямі осі осі осередків осередків), ніж у випадку з білками (див. Малюнок зліва).
Метод коливань
Спочатку дуже успішно застосовувалися методи обертання кристала з широким кутом повороту. Однак, коли він застосовувався до кристалів з більшими прямими осередками (тобто дрібними реципрокними клітинами), час збору збільшувався. Тому ці методи були замінені методами з використанням малих кутів коливань, що дозволяють збирати відразу кілька частин різних взаємних площин. Збирати цей тип діаграм при різних вихідних положеннях кристала достатньо для отримання достатньої кількості даних в розумні терміни. Геометрія колекції описана на малюнках, показаних нижче. У наш час, з обертовими анодними генераторами, синхронітронами та детекторами площі (пластини зображення або ПЗС, див. Нижче), цей метод широко використовується, особливо для білків.
Контур геометричних умов дифракції в коливальному методі. Кристал, а отже, і його зворотна решітка, коливаються в невеликому куті навколо осі (перпендикулярної площині фігури), яка проходить через центр. На малюнку праворуч зворотна область, яка проходить через умови дифракції, в межах сфери Евальда (з радіусом 2.sin 90/λ), позначена жовтим кольором. Максимальна роздільна здатність, яку можна отримати в експерименті, задається 2.sen θ max/λ).
Коли зворотна решітка коливається під невеликим кутом навколо осі обертання, невеликі ділянки різних взаємних площин перетнуть поверхню сфери Евальда, досягаючи умови дифракції. Таким чином, на екрані детектора будуть відображатися дифракційні плями з різних взаємних площин, що утворюють невеликі «лінії» на схемі (малюнок праворуч). «Лінія» - це плоска фігура, обмежена двома круговими дугами нерівних радіусів, тобто півмісяцем.
Чотири кола кутометри
Впровадження цифрових комп'ютерів в кінці 1970-х призвело до розробки так званих автоматичних чотирикругових дифрактометрів. Ці кутометри з дуже точною механікою та за допомогою трьох осей обертання дозволяють доводити зразки кристалів до будь-якої орієнтації в просторі, виконуючи вимоги Евальда щодо отримання дифракції. Після того, як кристал орієнтований, четверта вісь обертання, яка підтримує електронний детектор, розміщується в правильному положенні для збору дифракційного променя. Всі ці рухи можна запрограмувати в автоматичному режимі, з мінімальним втручанням оператора.
Дві різні кутометричні геометрії використовуються дуже успішно протягом багатьох років. У кутометрі Ейлера (див. Малюнок нижче) кристал орієнтований через три кути Ейлера (три кола): Φ являє собою вісь обертання навколо гоніометричної головки (де встановлений кристал), θ дозволяє кристала перекидатися по замкнутому колу, а ω дозволяє повному кутоміру обертатися навколо вертикальної осі. Четверте коло представляє обертання детектора, 2 θ, який співвісний з ω. Ця геометрія має перевагу високої механічної стійкості, але представляє деякі обмеження для зовнішніх пристроїв (наприклад, низькотемпературних або високотемпературних пристроїв) для доступу до кристала.
Зліва: Схема і зовнішній вигляд чотирикругового кутометра з геометрією Ейлера
Праворуч: Обертання в чотирикруговому кутометрі з геометрією Ейлера
Альтернативою ейлерівской геометрії є так звана геометрія Каппи, яка не має еквівалента замкнутої θ окружності. Роль Ейлеріана ρ обертання виконується за допомогою двох нових осей : (каппа) і ω (Див. Малюнок нижче), таким чином, що при комбінації обох нових кутів можна отримати Ейлерівські кути в діапазоні від -90 до +90 градусів. Головною перевагою цієї геометрії Kappa є широка доступність до кристала. Кути Φ і 2 θ ідентичні кутам в ейлерівській геометрії:
Схема і зовнішній вигляд чотирикругового кутометра з геометрією Каппа
Система виявлення, яка широко використовувалася протягом багатьох років для обох геометрій (Ейлера та Каппи), базувалася на лічильниках невеликої площі або точкових детекторах. За допомогою цих детекторів інтенсивність дифракційних променів повинна вимірюватися індивідуально, один за одним, і тому всі кути повинні бути змінені автоматично відповідно до раніше розрахованих значень. Типовий час вимірювання для таких детекторних систем становить близько 1 хвилини на одне відображення.
Одним з більш широко використовуваних протягом багатьох років точкових детекторів є сцинтиляційний лічильник, схема якого показана нижче:
Схема сцинтиляційного лічильника
Детектори площі
Як альтернатива точковим детекторам, розвиток електронних технологій призвело до появи так званих зонних детекторів, які дозволяють одночасно виявляти багато дифракційних променів, тим самим заощаджуючи час в експерименті. Ця технологія особливо корисна для білків і взагалі для будь-якого матеріалу, який може погіршуватися під час впливу рентгенівських променів, оскільки виявлення кожного зібраного зображення (з кількома сотнями відбитків) здійснюється за мінімальний час, близько хвилин (або секунд, якщо джерелом рентгенівського випромінювання є синхротрон).
Один з найбільш часто використовуваних детекторів області заснований на так званих CCD (Charge Coupled Device), схема яких наведена нижче:
Схематичний вигляд ПЗС з його основними складовими. Рентгенівський перетворювач, на малюнку показаний як фосфор, також може бути виготовлений з іншими матеріалами, такими як GDO тощо ПЗС перетворює рентгенівські фотони з високою швидкістю, але його недоліком є те, що він працює при дуже низьких температурах (близько -70 С). Зображення, взяте з продуктів ADSC
ПЗС-детектори типу зазвичай встановлюються на кутоміри Kappa і їх застосування широко поширене в області білкової кристалографії, з обертовими анодними генераторами або джерелами синхротронів.
Зліва: кутомір з геометрією Kappa та ПЗС-детектором (зображення, взяте з Bruker-AXS )
Праворуч: Деталі кутоміра Kappa (у цьому випадку з фіксованим кутом)
Іншим типом детектора, широко використовуваного сьогодні, особливо в кристалографії білка, є сканери Image Plate, які зазвичай встановлюються на відносно рудиментарному кутометрі, єдиною свободою якого є вісь обертання, паралельна осі кріплення кристалів. Сам датчик являє собою круглу пластину з чутливого до рентгенівських променів матеріалу. Після впливу лазер використовується для сканування пластини і зчитування інтенсивностей.
Зліва: Сканер пластин зображення. (зображення взято з Марксперта )
Праворуч: Компоненти сканера пластин зображення
Новітня технологія передбачає використання детекторів площі на основі технології CMOS (c комплементарною m метал-оксид як напівпровідник), що має дуже короткий час зчитування, що дозволяє збільшити частоту кадрів під час передачі даних. колекція.
Детектори площі
XALOC, лінія променя для високомолекулярної кристалографії (зліва) на іспанському синхротроні ALBA (праворуч)
Підсумовуючи, повний збір даних за допомогою цього типу детекторів складається з декількох зображень, таких як наведені нижче. Зібрані зображення згодом аналізуються з метою отримання даних кристалічної одиниці клітини, симетрії (просторової групи) та інтенсивностей дифракційної картини (зворотний простір). Більш докладно цей процес пояснюється в іншому розділі.
Ліворуч: Дифракційне зображення білка, отримане методом коливань у сканері Image Plate Scanner. Під час експозиції (приблизно 5 хвилин за допомогою генератора анода, що обертається, або приблизно 5 секунд на синхронітронному об'єкті) кристал обертається приблизно на 0,5 градуса навколо монтажної осі. Зчитування зображення займає близько 20 секунд (в залежності від площі зображення пластини). Це також може бути поява зображення, зробленого за допомогою ПЗС-детектора. Однак з ПЗС час експозиції був би коротшим.
Праворуч: набір послідовних дифракційних зображень, отриманих за допомогою сканера Image Plate Scanner або CCD детектора. Після декількох зображень з'являються два концентричних темних кола, відповідних нескінченній кількості зворотних точок. Вони відповідають двом послідовним порядкам дифракції випадково орієнтованих мікрокристалів льоду, які з'являються через якийсь дефект кріопротектора або певної вологості холодного азоту, використовуваного для охолодження зразка. Зображення взяті з лабораторії Джанет Сміт. Дивіться також приклад, опублікований Арітра Пал та Георг Шелдрік.
У всіх цих описаних експериментальних методологіях (крім методу Лауе) використовується випромінювання, як правило, монохроматичне (або майже монохроматичне), тобто випромінювання з однією довжиною хвилі. Монохроматичні випромінювання зазвичай отримують за допомогою так званих монохроматорів, системи, складеної монокристалами, які на основі Закону Брегга здатні «фільтрувати» поліхроматичне вхідне випромінювання і вибрати лише одну з його довжин хвиль ( колір), як показано нижче:
Схема монохроматора. Поліхроматичне випромінювання (біле), що йде зліва, «відбивається», згідно із Законом Брегга, «фільтруючи» вхідне випромінювання, яке відбивається знову на вторинному кристалі. Зображення взято з ESRF.
В даний час у кристалографічних лабораторіях або навіть в синхронітронних лініях традиційні монохроматори замінюються новими оптичними компонентами, які продемонстрували чудову ефективність. Ці компоненти, зазвичай відомі як «фокусуючі дзеркала», можуть базуватися на наступних явищах:
- повне відображення (дзеркала, капіляри і хвилеводи),
- заломлення (заломлення лінз) і
- дифракція (кристалічні системи на основі монохроматорів, багатошарових матеріалів і т.д.)
Також може бути дуже повчальним подивитися на цю анімовану діаграму, яка показує шлях кожного рентгенівського фотона в даній дифракційній системі:
- фотон залишає джерело, де виробляються рентгенівські промені,
- проходить через різні оптичні елементи, які направляють його в потрібному напрямку (дзеркала, щілини і коліматори)
- дифракти всередині монокристала, і
- остаточно генерує дифракційні плями на детекторі
Оригінальне відео можна побачити на сайті https://vimeo.com/52155723
Для того щоб отримати найбільшу і найкращу колекцію даних дифракції, зразки кристалів зазвичай підтримують при дуже низькій температурі (близько 100 К, тобто близько -170 С) за допомогою сухого потоку азоту. При низьких температурах кристали (і особливо макромолекул) більш стійкі і набагато краще протистоять впливу рентгенівського випромінювання. У той же час низька температура ще більше знижує атомні коефіцієнти теплової вібрації, полегшуючи їх подальше розташування всередині кристалічної структури.
Система охолодження з використанням сухого рідкого азоту. Зображення взято з Оксфордських кріосистем
Для кріплення кристалів на голівці кутометра, перед струменем холодного азоту, кристалографи використовують спеціальні петлі (на зразок тієї, що зображена на лівому малюнку), які фіксують кристал в матриці, прозорій для рентгенівських променів.
Особливо це корисно для білкових кристалів, де матриця також виступає в ролі кріопротектора (антифризу). Молекули кріо-протектора поширюються по кристалічних каналах, замінюючи молекули води кріопротекторними, тим самим уникаючи розриву кристалів через замерзлу воду.
Зліва: Деталь змонтованого кристала за допомогою петлі, заповненої матрицею антифризу
Праворуч: Перевірка положення кристала в кутометричному оптичному центрі. Відео люб'язно надано Едом Беррі
У будь-якому випадку кристалічний центр повинен збігатися з оптичним центром кутометра, куди також проходить рентгенівський промінь. Таким чином, коли кристал обертається, він завжди буде зосереджений на цій точці, і в будь-якому з його положень буде купатися рентгенівським променем.
Система кріозахисту, встановлена на кутомірі
Потік азоту при -170 º C (надходить через верхню трубку) охолоджує кристал, встановлений на голівці кутометра. Коліматор рентгенівського променя вказує в сторону кристала зліва від зображення. Зверніть увагу на незначну пару, що утворюється холодним азотом при змішуванні з вологістю повітря.
Візуально аналізуючи якість дифракційної картини
Підсумовуючи, всі ці методології можуть бути використані для отримання збору даних, що складається з трьох індексів Міллера та інтенсивності для кожного дифракційного пучка, тобто найбільшої кількості зворотних точок зворотної решітки.
Це передбачає оцінку як геометрії, так і інтенсивності всієї дифракційної картини.
Всі ці дані, розміри осередків кристалічної одиниці, симетрія кристала (просторова група) і інтенсивності, пов'язані з зворотними точками (дифракційний малюнок), дозволять нам «побачити» внутрішню будову кристала, але це питання буде показано в іншому розділі...