12.6: Інші форми хроматографії

На початку розділу 12.5 ми зазначили, що існує кілька різних типів розчинних/стаціонарних фазових взаємодій у рідинній хроматографії, але обмежили нашу дискусію рідинно-рідинною хроматографією. У цьому розділі ми звертаємо увагу на методи рідинної хроматографії, в яких розділення відбувається шляхом адсорбції рідини - твердого тіла, іонообміну та виключення розміру.

Рідинно-тверда хроматографія

У рідинно-твердій адсорбційній хроматографії (LSC) колонка також служить стаціонарною фазою. У оригінальній роботі Цветта стаціонарна фаза була тонко розділена CaCo ₃, але сучасні колонки використовують пористі 3-10 мкм частинки кремнезему або оксиду алюмінію. Оскільки стаціонарна фаза полярна, рухлива фаза зазвичай є неполярним або помірно полярним розчинником. Типові рухливі фази включають гексан, ізооктан та метиленхлорид. Звичайний порядок елюції - від коротшого до більш тривалого часу утримання -

олефіни < ароматичні вуглеводні < ефіри < ефіри, альдегіди, кетони < спирти, аміни < амід < карбонові кислоти

Застосовуються також неполярні стаціонарні фази, такі як абсорбенти на основі деревного вугілля. Для більшості зразків рідинно-тверда хроматографія не пропонує особливих переваг перед рідинно-рідинною хроматографією. Одним з винятків є аналіз ізомерів, де LSC перевершує.

Іонообмінна хроматографія

В іонообмінній хроматографії (IEC) стаціонарною фазою є зшита полімерна смола, як правило, дивінілбензол-зшитий полістирол, з ковалентно прикріпленими іонними функціональними групами (див. Рисунок Template:index і Таблиця {{Template.index (ID:1)}). Протидії цим фіксованим зарядам рухливі і витісняються іонами, які більш сприятливо конкурують для обмінних майданчиків. Іонообмінні смоли поділяються на чотири категорії: сильні катіонообмінники кислоти; слабкі катіонні обмінники кислоти; потужні базові аніонообмінники; і слабкі базові аніонообмінники.

Рисунок Template:index. Зліва показані структури стиролу, дивінілбензолу та сополімеру стирол-дивінілбензолу, модифікованого для використання як іонообмінної смоли. Іонообмінні сайти, позначені R і показані синім кольором, в основному знаходяться в положенні пара-класу і не обов'язково пов'язані з усіма стирольними одиницями. Зшивання показано червоним кольором. На фото праворуч показаний приклад полімерних намистин. Ці намистини мають діаметр приблизно 0,30-0,85 мм. Смоли для використання в іонообмінній хроматографії зазвичай мають діаметр 5-11 мкм.

Таблиця Template:index. Приклади поширених іонообмінних смол

тип	функціональна група	приклади
сильний кислотний катіонний обмінник	сульфонова кислота	\(-\text{SO}_3^-\) \(-\text{CH}_2\text{CH}_2\text{SO}_3^-\)
слабкий кислотний катіонний обмінник	карбонова кислота	\(-\text{COO}^-\) \(-\text{CH}_2\text{COO}^-\)
міцний базовий аніонний обмінник	четвертинний амін	\(-\text{CH}_2\text{N(CH}_3)_3^+\) \(-\text{CH}_2\text{CH}_2\text{N(CH}_2\text{CH}_3)_3^+\)
слабке підставу аніонообмінника	амін	\(-\text{NH}_4^+\) \(-\text{CH}_2\text{CH}_2\text{NH(CH}_2\text{CH}_3)_3^+\)

Сильні кислотні катіоніти включають функціональну групу сульфонової кислоти, яка зберігає її аніонну форму - і, отже, її здатність до іонообміну - у сильнокислих розчині. Функціональні групи для слабкого катіонного обмінника кислоти, з іншого боку, повністю протонуються при рівнях рН менше 4 і втрачають свою обмінну здатність. До сильної бази аніонообмінників відноситься четвертинний амін, який зберігає позитивний заряд навіть в сильно базових рішеннях. Слабкі базові аніонообмінники залишаються протонованими лише при рівнях рН, які є помірно основними. При більш елементарних умовах слабке базове аніонообмінник втрачає протон і свою обмінну здатність.

Іонообмінна реакція одновалентного катіону, M ⁺, обмінна ділянка

\[-\mathrm{SO}_{3}^{-} \mathrm{H}^{+}(s)+\mathrm{M}^{+}(a q)\rightleftharpoons-\mathrm{SO}_{3}^{-} \mathrm{M}^{+}(s)+\mathrm{H}^{+}(a q) \nonumber\]

Константа рівноваги для цієї іонообмінної реакції, яку ми називаємо коефіцієнтом селективності, К, дорівнює

\[K=\frac{\left\{-\mathrm{SO}_{3}^{-} \mathrm{M}^{+}\right\}\left[\mathrm{H}^{+}\right]}{\left\{-\mathrm{SO}_{3}^{-} \mathrm{H}^{+}\right\}\left[\mathrm{M}^{+}\right]} \label{12.1}\]

де ми використовуємо фігурні дужки, {}, щоб вказати поверхневу концентрацію замість концентрації розчину.

Ми зазвичай не думаємо про концентрацію твердого тіла. Для цього є вагома причина. У більшості випадків концентрація твердої речовини є постійною. Якщо розбити шматочок крейди на дві частини, наприклад, маса і обсяг кожного шматочка зберігає таку ж пропорційну залежність, як і в вихідному шматку крейди. Однак, коли ми розглядаємо іонне зв'язування з реактивним місцем на поверхні твердого тіла, частка ділянок, які пов'язані, і, отже, концентрація пов'язаних ділянок, може приймати будь-яке значення між 0 і деяким максимальним значенням, пропорційним щільності реактивних ділянок.

Перестановка рівняння\ ref {12.1} показує нам, що коефіцієнт розподілу, D, для реакції обміну

\[D=\frac{\text { amount of } \mathrm{M}^{+} \text { in the stationary phase }}{\text { amount of } \mathrm{M}^{+} \text { in the mobile phase }} \nonumber\]

\[D=\frac{\left\{-\mathrm{SO}_{3}^{-} \mathrm{M}^{+}\right\}}{\left[\mathrm{M}^{+}\right]}=K \times \frac{\left\{-\mathrm{SO}_{3}^{-} \mathrm{H}^{+}\right\}}{\left[\mathrm{H}^{+}\right]} \label{12.2}\]

є функцією концентрації Н ⁺ і, отже, рН рухомої фази.

Вибірковість іонообмінної смоли дещо залежить від того, чи включає вона сильні чи слабкі обмінні сайти та від ступеня зшивання. Останнє особливо важливо, оскільки контролює проникність смоли, а отже, і доступність обмінних майданчиків. Приблизний порядок селективності для типової сильнокислотної катіонообмінної смоли, в порядку зменшення D, дорівнює

Аль ^{3 +} > Ба ²⁺ > Пб ^{2 +} > Са ^{2 +} > Ni ^{2 +} > Cd ^{2 +} > Cu ^{2 +} > Co ^{2 +} > Zn ^{2 +} > Mg ^{2 +} > Ag ⁺ > K ⁺ >\(\text{NH}_4^+\) > Na ⁺ > H ⁺ > Li ⁺

Зверніть увагу, що сильно заряджені катіони зв'язуються сильніше, ніж катіони нижчого заряду, і що для катіонів подібного заряду ті, що мають менший гідратований радіус (див. Таблицю 6.9.1 в главі 6), або які є більш поляризуючими, зв'язуються сильніше. Для міцного базового аніонного обмінника загальний порядок елюції становить

\(\text{SO}_4^{2-}\)^{> I — >\(\text{HSO}_4^-\) >\(\text{NO}_3^-\) > Br —\(\text{NO}_2^-\) > Cl\(\text{HCO}_3^-\) -> СН3СОО -> ОН -> F —}

Аніони більш високого заряду і меншого гідратного радіуса зв'язуються сильніше аніонів з меншим зарядом і більшим гідратованим радіусом.

Рухлива фаза в МЕК зазвичай являє собою водний буфер, рН та іонний склад якого визначає час утримання розчиненої речовини. Можливі градієнтні елюції, при яких іонна сила рухомої фази або рН змінюється з часом. Наприклад, розділення катіонів IEC може використовувати розведений розчин HCl як рухому фазу. Збільшення концентрації HCl прискорює швидкість елюції для більш сильно утримуваних катіонів, оскільки більша концентрація Н ⁺ дозволяє йому більш успішно конкурувати за іонообмінні ділянки.

З Equation\ ref {12.2} коефіцієнт розподілу катіону, D, стає меншим, коли концентрація H ⁺ в рухомій фазі збільшується.

Іонообмінна смола включена в колонку ВЕРХ або у вигляді пористих полімерних кульок 5-11 мкм, або шляхом покриття смоли на пористі частинки кремнезему. Колони зазвичай мають довжину 250 мм з внутрішніми діаметрами в межах 2-5 мм.

Вимірювання провідності рухомої фази при її елюації з колони служить універсальним детектором катіонних і аніонних аналітів. Оскільки рухлива фаза містить високу концентрацію іонів — наприклад, рухому фазу розведеного HCl, містить значні концентрації ^H+ та Cl ^— нам потрібен метод виявлення аналітів за наявності значної фонової провідності.

Щоб мінімізувати внесок рухомої фази в провідність, між аналітичною колоною і детектором розміщується колонка іоносупресора. Ця колонка вибірково видаляє рухомі фазові іони без видалення розчинених іонів. Наприклад, в катионообмінної хроматографії з використанням розведеного розчину HCl в якості рухомої фази супресорна колонка містить сильну основу аніонообмінної смоли. Реакція обміну

\[\mathrm{H}^{+}(a q)+\mathrm{Cl}^{-}(a q)+\mathrm{Resin}^{+} \mathrm{OH}^{-}(s)\rightleftharpoons\operatorname{Resin}^{+} \mathrm{Cl}^{-}(s)+\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}(l ) \nonumber\]

замінює рухомі фазові іони Н ⁺ і Cl ^— на Н ₂ О. Аналогічний процес застосовується в аніонообмінної хроматографії, де колонка супресора містить катионообмінну смолу. Якщо рухливою фазою є розчин Na ₂ CO ₃, реакція обміну

\[2 \mathrm{Na}^{+}(a q)+\mathrm{CO}_{3}^{2-}(a q)+2 \operatorname{Resin}^{-} \mathrm{H}^{+}(s)\rightleftharpoons2 \operatorname{Resin}^{-} \mathrm{Na}^{+}(s)+\mathrm{H}_{2} \mathrm{CO}_{3}(a q) \nonumber\]

замінює сильний електроліт, Na ₂ CO ₃, зі слабким електролітом, H ₂ CO ₃.

Іонне придушення необхідно, коли рухлива фаза містить високу концентрацію іонів. Одноколонкова іонна хроматографія, при якій не потрібна іонно-супресорна колонка, можлива, якщо концентрація іонів в рухомій фазі невелика. Зазвичай стаціонарна фаза являє собою смолу з низькою ємністю для іонообміну, а рухома фаза являє собою дуже розбавлений розчин метаносульфонової кислоти для катіонних аналітів, або бензоат калію або гідрофталат калію для аніонних аналітів. Оскільки фонова провідність досить мала, можна контролювати зміну провідності, коли аналіти елітуються з колони.

Детектор поглинання UV/Vis може бути використаний, якщо аналіти поглинають ультрафіолетове або видиме випромінювання. Крім того, ми можемо виявити опосередковано аналіти, які не поглинають в УФ/ВІС, якщо рухлива фаза містить вид, що поглинає УФ/ВІС. У цьому випадку, коли смуга розчинених речовин проходить через детектор, на детекторі вимірюється зменшення поглинання.

Іонообмінна хроматографія є важливою методикою аналізу аніонів і катіонів у воді. Наприклад, іонообмінний хроматографічний аналіз для аніонів F ^—, Cl ^—, Br ^—,\(\text{NO}_2^-\)\(\text{NO}_3^-\)\(\text{PO}_4^{3-}\), і\(\text{SO}_4^{2-}\) займає приблизно 15 хвилин (рис. Template:index). Для повного аналізу одного і того ж набору аніонів за допомогою комбінації потенціометрії і спектрофотометрії потрібно 1—2 дні. Іонообмінна хроматографія також використовується для аналізу білків, амінокислот, цукрів, нуклеотидів, фармацевтичних препаратів, споживчих товарів та клінічних зразків.

Рисунок Template:index. Іонообмінний хроматографічний аналіз води з Big Walnut Creek в окрузі Патнам, штат Індіана. Дані, надані Жанетт Поуп, кафедра наук про Землю, Університет ДеПо.

Хроматографія з виключенням розміру

У цьому розділі ми розглянули два класи мікронних стаціонарних фаз: частинки кремнезему та зшиті кульки полімерної смоли. Обидва матеріали пористі, розміри пір коливаються приблизно від 5-400 нм для частинок кремнезему та від 5 нм до 100 мкм для дивінілбензольних зшитих полістирольних смол. У хроматографії з виключенням розмірів - яка також відома під термінами молекулярно-виключення або гель-проникнення хроматографії - поділ розчинених речовин залежить від їх здатності входити в пори стаціонарної фази. Менші розчинені речовини витрачають пропорційно більше часу в порах і займають більше часу, щоб вивести з колони.

Селективність розміру стаціонарної фази поширюється на скінченний діапазон. Всі розчинені речовини, значно менші за пори, рухаються по всьому об'єму колони і елітуються одночасно, з утримуючим об'ємом, V _{r, або}

\[V_{r}=V_{i}+V_{o} \label{12.3}\]

де V _i - об'єм рухомої фази, що займає поровий простір стаціонарної фази, а V _o - об'єм рухомої фази в решті колони. Найбільшою розчиненою речовиною, для якої є Equation\ ref {12.3}, є межа включення стовпця або межа проникнення. Ці розчинені речовини занадто великі, щоб увійти в пори елітуються одночасно з утримуючим об'ємом

\[V_{r} = V_{o} \label{12.4}\]

Рівняння\ ref {12.4} визначає межу виключення стовпця.

Для розчиненої речовини, розмір якого знаходиться між межею включення і межею виключення, кількість часу, який він проводить в порах стаціонарної фази, пропорційна його розміру. Обсяг утримання цих розчинених речовин становить

\[V_{r}=DV_{i}+V_{o} \label{12.5}\]

де D - коефіцієнт розподілу розчиненої речовини, який коливається від 0 на межі виключення до 1 на межі включення. Рівняння\ ref {12.5} передбачає, що розмірно-виключення є єдиною взаємодією між розчиненою речовиною і стаціонарною фазою, яка впливає на поділ. З цієї причини стаціонарні фази з використанням частинок кремнезему деактивуються, як описано раніше, а полімерні смоли синтезуються без обмінних місць.

Хроматографія з виключенням розмірів забезпечує швидкий засіб для поділу більших молекул, включаючи полімери та біомолекули. Стаціонарна фаза для білків, яка складається з частинок з 30 нм порами, має межу включення 7500 г/моль і межу виключення\(1.2 \times 10^6\) г/моль. Суміші білків, що охоплюють більш широкий діапазон молекулярних мас, розділяються шляхом з'єднання послідовно декількох стовпців з різними межами включення і виключення.

Іншим важливим застосуванням хроматографії для виключення розміру є оцінка молекулярної маси розчиненої речовини (МВт). Калібрувальні криві готуються з використанням серії стандартів відомої молекулярної маси та вимірювання об'єму утримання кожного стандарту. Як показано на малюнку Template:index}, графік журналу (MW) проти V _r приблизно лінійний між межею виключення та лімітом включення. Оскільки на обсяг утримання розчиненої речовини впливають як його розмір, так і форма, досить точна оцінка молекулярної маси можлива лише в тому випадку, якщо стандарти підібрані ретельно, щоб мінімізувати ефект форми.

Рисунок Template:index. Калібрувальна крива для визначення молекулярної маси методом розмірно-виключної хроматографії. Дані, наведені тут, адаптовані з Руессака, Ф.; Руессак, А. хімічний аналіз: сучасні методи та методи приладобудування, Wiley: Chichester, Англія, 2004, стор 141.

Хроматографія з виключенням розмірів проводиться за допомогою звичайних приладів ВЕРХ, замінюючи колонку ВЕРХ відповідною колонкою виключення розміру. УФ/Віз-детектор є найпоширенішим засобом для отримання хроматограми.

Надкритична рідинна хроматографія

Хоча існує багато аналітичних застосувань газової хроматографії та рідинної хроматографії, вони не можуть розділити та аналізувати всі типи зразків. Капілярна колонка ГК відокремлює складні суміші з відмінною роздільною здатністю і коротким часом аналізу. Однак його застосування обмежується летючими аналітами або аналітами, зробленими летючими відповідною реакцією дериватизації. Рідинна хроматографія відокремлює більш широкий спектр розчинених речовин, ніж GC, але найпоширеніші детектори - УФ, флуоресцентні та електрохімічні - мають бідніші межі виявлення та менші лінійні діапазони, ніж детектори GC, і не настільки універсальні за своєю селективністю.

Для деяких зразків надкритична рідинна хроматографія (SFC) забезпечує корисну альтернативу газовій хроматографії та рідинної хроматографії. Рухливою фазою в надкритичної рідинної хроматографії є газ, що утримується при температурі і тиску, що перевищує її критичну точку (рис. Template:index). У цих умовах рухлива фаза не є ні газом, ні рідиною. Натомість рухлива фаза - це надкритична рідина.

Рисунок Template:index. Фазова діаграма, що показує комбінації температури та преса- впевнені, для яких з'єднання знаходиться в твердому стані, рідкому стані та газовому стані. Для тисків і температур вище критичної точки з'єднання являє собою надкритичну рідину з властивостями, проміжними між газом і рідиною. Натисніть тут, щоб побачити цікаву відео-демонстрацію надкритичних рідин з Ноттінгемського наукового міста в Ноттінгемському університеті.

Деякі властивості надкритичної рідини, як показано в таблиці Template:index, подібні до газу; інші властивості, однак, подібні до рідини. Наприклад, в'язкість надкритичної рідини схожа на газ, що означає, що ми можемо переміщати надкритичну рідину через капілярну колону або упаковану колону без високих тисків, необхідних у ВЕРХ. Час аналізу та роздільна здатність, хоча і не такі хороші, як у GC, зазвичай кращі, ніж у звичайній ВЕРХ. Щільність надкритичної рідини, з іншого боку, набагато ближче до щільності рідини, що пояснює, чому надкритичні рідини є хорошими розчинниками. Що стосується своєї роздільної потужності, рухлива фаза в SFC поводиться більше як рідка рухлива фаза у ВЕРХ, ніж газоподібна рухлива фаза в ГК.

Таблиця Template:index. Типові властивості газів, рідин та надкритичних рідин

фаза	щільність (г/см ^3)	в'язкість (г см ^-1 с ^-1)	коефіцієнт дифузії (см ^2 с ^-1)
газ	\(\approx 10^{-3}\)	\(\approx 10^{-4}\)	\(\approx 0.1\)
надкритична рідина	\(\approx 0.1 - 1\)	\(\approx 10^{-4} - 10^{-3}\)	\(\approx 10^{-4} - 10^{-3}\)
рідкий	\(\approx 1\)	\(\approx 10^{-2}\)	\(\approx 10^{-3}\)

Найпоширенішою рухомою фазою для надкритичної рідинної хроматографії є CO ₂. Його низька критична температура 31,1 ^o С та низький критичний тиск 72,9 атм відносно легко досягти та підтримувати. Хоча надкритичний СО ₂ є хорошим розчинником для неполярної органіки, він менш корисний для полярних розчинів. Додавання органічного модифікатора, такого як метанол, покращує міцність елюції рухомої фази. Інші поширені рухливі фази та їх критичні температури та тиск наведені в таблиці Template:index.

Таблиця Template:index. Критичні точки для обраних надкритичних рідин

з'єднання	критична температура (^o С)	критичний тиск (атм)
вуглекислий газ	31.3	72.9
етану	32.4	48.3
закис азоту	36.5	71.4
нашатирний спирт	132.3	111.3
діетиловий ефір	193.6	36.3
ізопропанол	235.3	47.0
метанол	240.5	78.9
етанолу	243.4	63.0
вода	374.4	226,8

Прилади для надкритичної рідинної хроматографії по суті такі ж, як і для стандартної ВЕРХ. Єдині важливі доповнення - нагріта піч для колонки і обмежувач тиску нижче за течією від колонки для підтримки критичного тиску. Градієнтні елюції досягаються шляхом зміни прикладеного тиску з плином часу. Отримане в результаті зміна щільності рухомої фази впливає на її міцність розчинника. Виявлення здійснюється за допомогою стандартних детекторів GC або детекторів ВЕРХ. Надкритична рідинна хроматографія має багато застосувань при аналізі полімерів, викопного палива, восків, ліків та харчових продуктів.