12.5: Високопродуктивна рідинна хроматографія
- Page ID
- 24904
У високоефективній рідинній хроматографії (ВЕРХ) ми вводимо зразок, який знаходиться у формі розчину, у рідку рухливу фазу. Рухлива фаза переносить зразок через упаковану або капілярну колону, яка розділяє компоненти зразка на основі їх здатності розділяти між рухомою фазою і стаціонарною фазою. На малюнку Template:index показано приклад типового приладу ВЕРХ, який має кілька ключових компонентів: резервуари, що зберігають рухливу фазу; насос для проштовхування рухомої фази через систему; інжектор для введення зразка; колонку для поділу зразка на складові частини; і детектор для спостереження за елюентом при його відриві від колонки. Розглянемо кожен з цих складових.
Час утримання розчиненої речовини у ВЕРХ визначається його взаємодією зі стаціонарною фазою та рухомою фазою. Існує кілька різних типів взаємодій розчинних/стаціонарних фаз, включаючи адсорбцію рідина - тверда речовина, розділення рідина - рідина, іонний обмін та виключення розміру. Цей розділ стосується виключно поділу ВЕРХ на основі розділення рідини та рідини. Інші форми рідинної хроматографії розглядаються в розділі 12.6.
Стовпці ВЕРХ
ВЕРХ зазвичай включає дві колонки: аналітичну колону, яка відповідає за поділ, і захисну колону, яка розміщується перед аналітичною колоною, щоб захистити її від забруднення.
Аналітичні стовпці
Найбільш поширеним типом колонки ВЕРХ є трубка з нержавіючої сталі з внутрішнім діаметром від 2,1 мм до 4,6 мм і довжиною від 30 мм до 300 мм (рис. Template:index). Колонка упакована 3-10 мкм пористими частинками кремнезему або неправильної, або сферичної форми. Типовий ККД колони 40000 - 60000 теоретичних плит/м Припускаючи V макс/V хв приблизно 50, 25-см колона з 50 000 плит/м має 12 500 теоретичних пластин і пікову потужність 110.
Капілярні колонки використовують менше розчинника і, оскільки зразок розбавляється в меншій мірі, виробляють більші сигнали на детекторі. Ці колони виготовляються з плавленого кремнезему капілярів з внутрішніми діаметрами від 44—200 мкм і довжиною 50-250 мм. Капілярні колони, упаковані частинками 3—5 мкм, підготовлені з коефіцієнтом корисної дії колони до 250 000 теоретичних пластин [Новотони, М.Наука, 1989, 246, 51—57].
Одним з обмежень для упакованої капілярної колони є протитиск, який розвивається при перекачуванні рухомої фази через невеликі міжстиціальні простори між частинами мікронного розміру пакувального матеріалу (рис. Template:index). Оскільки трубки та фітинги, які несуть рухливу фазу, мають обмеження тиску, більш високий зворотний тиск вимагає меншої швидкості потоку та довшого часу аналізу. Монолітні колони, в яких тверда опора є одним, пористим стрижнем, пропонують ефективність колони, еквівалентну упакованій капілярній колоні, забезпечуючи при цьому більш швидкі витрати. Монолітна колона, яка зазвичай за розміром схожа на звичайну упаковану колону, хоча і менші, капілярні колони також доступні - готується шляхом формування монолітного стрижня у формі та покриття його трубкою з ПТФЕ або полімерною смолою. Монолітні стрижні, виготовлені з силікагелевого полімеру, зазвичай мають макропори діаметром приблизно 2 мкм і мезопори - пори всередині макропор - діаметром приблизно 13 нм [Cabrera, K. Chromatography Online, 1 квітня 2008].
Охоронні колони
Дві проблеми, як правило, скорочують термін служби аналітичної колонки. По-перше, розчинені речовини, які необоротно зв'язуються зі стаціонарною фазою, погіршують продуктивність колонки, зменшуючи кількість стаціонарної фази, доступної для здійснення поділу. По-друге, твердий матеріал, що впорскується зі зразком, може засмітити аналітичну колону. Щоб мінімізувати ці проблеми, ми ставимо охоронну колонку перед аналітичною колоною. Колона Guard зазвичай містить той самий пакувальний матеріал для твердих частинок та стаціонарну фазу, що і аналітична колона, але значно коротша і менш дорога - довжина 7,5 мм і вартість однієї десятої від вартості для відповідної аналітичної колонки типова. Оскільки вони призначені для жертовних, охоронні колони замінюються регулярно.
Якщо ви уважно подивитеся на рисунок Template:index, ви побачите невеликий стовпець захисту трохи вище аналітичного стовпця.
Стаціонарні фази для рідинно-рідинної хроматографії
У рідинно-рідинної хроматографії стаціонарною фазою є рідка плівка, покрита пакувальним матеріалом, як правило, 3-10 мкм пористих частинок кремнезему. Оскільки стаціонарна фаза може бути частково розчинна в рухомій фазі, вона може елютувати або кровоточити з колони з часом. Щоб запобігти втраті стаціонарної фази, яка скорочує термін служби колони, вона ковалентно пов'язана з частинками кремнезему. Зв'язані стаціонарні фази створюються шляхом взаємодії частинок кремнезему з органохлорсиланом загальної форми Si (CH 3) 2 rCl, де R - алкільна або заміщена алкільна група.
Щоб запобігти небажаним взаємодіям між розчиненими речовинами та будь-якими іншими групами —SiOH, Si (CH 3) 3 Cl використовується для перетворення сайтів, які не реагували на\(–\text{SiOSi(CH}_3)_3\); такі стовпці позначаються як кінцеві.
Властивості стаціонарної фази залежать від алкільної групи органосилану. Якщо R - полярна функціональна група, то стаціонарна фаза - полярна. Приклади полярних стаціонарних фаз включають ті, де R містить ціано (—C 2 H 4 CN), діол (—C 3 H 6 OCH 2 CHOHCH 2 OH) або аміногенну (—C 3 H 6 NH 2) функціональну групу. Оскільки стаціонарна фаза полярна, рухлива фаза є неполярним або помірно полярним розчинником. Поєднання полярної стаціонарної фази і неполярної рухомої фази називається нормально-фазової хроматографією.
У хроматографії зворотної фази, яка є більш поширеною формою ВЕРХ, стаціонарна фаза неполярна, а рухлива фаза - полярна. Найбільш поширені неполярні стаціонарні фази використовують органохлорсилан, де група R - це вуглеводневий ланцюг n -октил (C 8) або n -октилдецил (С 18). Більшість розділень зворотної фази здійснюються з використанням буферного водного розчину як полярної рухомої фази або з використанням інших полярних розчинників, таких як метанол та ацетонітрил. Оскільки кремнеземний субстрат може піддаватися гідролізу в основних розчині, рН рухомої фази повинен бути менше 7,5.
Здається дивним, що більш поширена форма рідинної хроматографії ідентифікується як зворотна фаза замість нормальної фази. Ви можете згадати, що одним з найбільш ранніх прикладів хроматографії було поділ Михайла Цветта рослинних пігментів за допомогою полярної колони карбонату кальцію і неполярної рухомої фази петролейного ефіру. Отже, присвоєння нормального та зворотного значення - це все про пріоритет.
Мобільні фази
Порядок елюції розчинених речовин у ВЕРХ регулюється полярністю. Для нормального поділу фаз розчинена речовина нижчої полярності витрачає пропорційно менше часу в полярній стаціонарній фазі і елюює перед більш полярним розчиненою речовиною. Враховуючи певну стаціонарну фазу, час утримання в нормальній фазі ВЕРХ контролюється регулюванням властивостей рухомої фази. Наприклад, якщо роздільна здатність між двома розчиненими речовинами є поганим, перехід на менш полярну рухливу фазу зберігає розчинені речовини на колонці протягом більш тривалого часу і надає більше можливостей для їх поділу. У ВЕРХ із зворотною фазою порядок елюції протилежний, ніж при розділенні нормальної фази, при першому елююванні більшої кількості полярних розчинів. Збільшення полярності рухомої фази призводить до більш тривалого часу утримання. Більш короткі терміни утримання вимагають рухливої фази нижчої полярності.
Вибір мобільної фази: використання індексу полярності
Існує кілька індексів, які допомагають у виборі рухомої фази, одним з яких є індекс полярності [Снайдер, Л.Р.; Glajch, J. L.; Kirkland, J. Практична розробка методу ВЕРХ, Wiley-Inter- наука: Нью-Йорк, 1988]. Таблиця Template:index містить значення індексу полярності\(P^{\prime}\), для декількох поширених рухомих фаз, де більші значення\(P^{\prime}\) відповідають більшій кількості полярних розчинників. Змішування двох або більше мобільних фаз, припускаючи, що вони змішуються - створює рухливу фазу проміжної полярності. Наприклад, бінарна рухлива фаза, зроблена шляхом поєднання розчинника А і розчинника В, має індекс полярності\(P_{AB}^{\prime}\),
\[P_{A B}^{\prime}=\Phi_{A} P_{A}^{\prime}+\Phi_{B} P_{B}^{\prime} \label{12.1}\]
де\(P_A^{\prime}\) і\(P_B^{\prime}\) є показниками полярності для розчинників A і B,\(\Phi_A\) а\(\Phi_B\) також об'ємні частки для двох розчинників.
| рухлива фаза | індекс полярності (\(P^{\prime}\)) | УФ-відсічення (нм) |
|---|---|---|
| циклогексан | \ (P^ {\ прайм}\)) ">0.04 | 210 |
| n -гексан | \ (P^ {\ прайм}\)) ">0.1 | 210 |
| чотирихлористий вуглець | \ (P^ {\ прайм}\)) ">1.6 | 265 |
| i-пропіловий ефір | \ (P^ {\ прайм}\)) ">2.4 | 220 |
| толуолу | \ (P^ {\ прайм}\)) ">2.4 | 286 |
| діетиловий ефір | \ (P^ {\ прайм}\)) ">2.8 | 218 |
| тетрагідрофуран | \ (P^ {\ прайм}\)) ">4.0 | 220 |
| етанолу | \ (P^ {\ прайм}\)) ">4.3 | 210 |
| етилацетат | \ (P^ {\ прайм}\)) ">4.4 | 255 |
| діоксан | \ (P^ {\ прайм}\)) ">4.8 | 215 |
| метанол | \ (P^ {\ прайм}\)) ">5.1 | 210 |
| ацетонітрил | \ (P^ {\ прайм}\)) ">5.8 | 190 |
| вода | \ (P^ {\ прайм}\)) ">10.2 | — |
Розділення ВЕРХ зворотної фази здійснюється за допомогою рухомої фази 60% в/в води і 40% в/в метанолу. Що таке індекс полярності рухливої фази?
Рішення
Використовуючи рівняння\ ref {12.1} та значення в таблиці Template:index, індекс полярності суміші вода-метанол 60:40 дорівнює
\[P_{A B}^{\prime}=\Phi_\text{water} P_\text{water}^{\prime}+\Phi_\text{methanol} P_\text{methanol}^{\prime} \nonumber\]
\[P_{A B}^{\prime}=0.60 \times 10.2+0.40 \times 5.1=8.2 \nonumber\]
Припустимо, вам потрібна рухлива фаза з показником полярності 7,5. Поясніть, як можна підготувати цю рухливу фазу за допомогою метанолу та води.
- Відповідь
-
Якщо ми дозволимо х бути часткою води в рухомій фазі, то 1 — х - частка метанолу. Підставляємо ці значення в рівняння\ ref {12.1} та розв'язуємо для x
\[7.5=10.2 x+5.1(1-x) \nonumber\]
\[7.5=10.2 x+5.1-5.1 x \nonumber\]
\[2.4=5.1 x \nonumber\]
дає х як 0,47. Рухливою фазою є 47% в/в води і 53% в/в метанолу.
Як правило, двоодинична зміна індексу полярності відповідає приблизно 10-кратній зміні коефіцієнта утримання розчиненої речовини. Ось простий приклад. Якщо коефіцієнт утримання розчиненої речовини, k, становить 22 при використанні води в якості рухомої фази (\(P^{\prime}\)= 10,2), то перехід на рухливу фазу 60:40 вода-метанол (\(P^{\prime}\)= 8,2) зменшується до приблизно 2,2. Зверніть увагу, що коефіцієнт утримання стає меншим, оскільки ми переходимо від більш полярної рухомої фази до менш полярної рухомої фази при розділенні зворотної фази.
Вибір мобільної фази: регулювання селективності
Зміна індексу полярності мобільної фази змінює коефіцієнт утримання розчиненої речовини. Однак, як ми дізналися в розділі 12.3, зміна k не є ефективним способом покращення роздільної здатності, коли початкове значення k перевищує 10. Для кращого поділу між двома розчиненими речовинами ми повинні покращити коефіцієнт селективності\(\alpha\). Існує два загальних методу збільшення\(\alpha\): додавання в рухому фазу реагенту, який реагує з розчиненими речовинами в реакції вторинної рівноваги або перехід на іншу рухливу фазу.
Скористатися реакцією вторинної рівноваги є корисною стратегією для поліпшення поділу [(a) Фолі, J.P. Хроматографія, 1987, 7, 118—128; (б) Фолі, J.P.; May, W.E. Anal. Хім. 1987, 59, 102—109; (с) Фолі, Дж. П.; Мей, В. Е. Хім. 1987, 59, 110—115]. На малюнку 12.3.3 , який ми розглядали раніше в цьому розділі, показано розділення чотирьох слабких кислот у зворотній фазі - бензойної кислоти, терефталевої кислоти, р-амінобензойної кислоти та р-гідроксибензойної кислоти - на неполярній колонці C 18 за допомогою водного буфера оцтової кислоти і ацетат натрію як рухлива фаза. Час утримання цих слабких кислот коротший при використанні менш кислої рухомої фази, оскільки кожна розчинена речовина присутня в аніонній, слабкій формі основи, яка менш розчинна в неполярній стаціонарній фазі. Якщо рН рухливої фази досить кислий, розчинені речовини присутні у вигляді нейтральних слабких кислот, які більш розчинні в стаціонарній фазі і займають більше часу для елюції. Оскільки слабкі розчинені речовини кислоти не мають однакових значень p K a, рН рухомої фази по-різному впливає на час утримання кожного розчиненого речовини, що дозволяє нам знайти оптимальний рН для повного поділу чотирьох розчинених речовин.
Кислотно-основна хімія не є єдиним прикладом реакції вторинної рівноваги. Інші приклади включають іонне сполучення, комплексоутворення та взаємодію розчинених речовин з міцелами. Останній з них ми розглянемо в розділі 12.7, коли ми обговорюємо міцелярну електрокінетичну капілярну хроматографію.
У прикладі Template:index ми навчилися регулювати полярність мобільної фази шляхом змішування двох розчинників. Індекс полярності, однак, є лише орієнтиром, і бінарні рухливі фазові суміші з однаковими показниками полярності можуть не однаково вирішити пару розчинених речовин. Наприклад, таблиця Template:index} показує час утримання чотирьох слабких кислот у двох рухомих фазах з майже однаковими значеннями для\(P^{\prime}\). Хоча порядок елюції однаковий для обох рухомих фаз, на час утримання кожного розчиненого речовини по-різному впливає вибір органічного розчинника. Якщо ми перейдемо від використання ацетонітрилу до тетрагідрофурану, наприклад, ми виявимо, що бензойна кислота елююється швидше і що р -гідроксибензойна кислота елююється повільніше. Хоча ми можемо повністю вирішити ці дві розчинні речовини, використовуючи рухливу фазу, яка становить 16% в/в ацетонітрилу, ми не можемо їх вирішити, якщо рухлива фаза становить 10% тетрагідрофурану.
| час утримання (хв) |
16% ацетонітрилу (СН 3 CN) 84% рН 4,11 водний буфер (\(P^{\prime}\)= 9,5) |
10% тетрагідрофуран (THF) 90% рН 4,11 водний буфер (\(P^{\prime}\)= 9,6) |
|---|---|---|
| \(t_\text{r, BA}\) | \ (P^ {\ прайм}\) = 9.5) ">5.18 | \ (P^ {\ прайм}\) = 9.6) ">4.01 |
| \(t_\text{r, PH}\) | \ (P^ {\ прайм}\) = 9.5) ">1.67 | \ (P^ {\ прайм}\) = 9.6) ">2.91 |
| \(t_\text{r, PA}\) | \ (P^ {\ прайм}\) = 9.5) ">1.21 | \ (P^ {\ прайм}\) = 9.6) ">1.05 |
| \(t_\text{r, TP}\) | \ (P^ {\ прайм}\) = 9.5) ">0.23 | \ (P^ {\ прайм}\) = 9.6) ">0.54 |
| \ (P^ {\ прайм}\) = 9.6) ">
Ключ: BA - бензойна кислота; РН - р -гідроксибензойна кислота; ПА - р -амінобензойна кислота; TP - терефталева кислота |
||
Однією зі стратегій пошуку найкращої мобільної фази є використання трикутника розчинника, показаного на рисунку Template:index, що дозволяє досліджувати широкий спектр мобільних фаз лише за сім експериментів. Ми починаємо з регулювання кількості ацетонітрилу в рухомій фазі для отримання найкращого можливого поділу протягом бажаного часу аналізу. Далі ми використовуємо таблицю Template:index для оцінки складу рухливих фаз метанолу/H 2 O та тетрагідрофуран/H 2 O, які дадуть аналогічний час аналізу. Чотири додаткові мобільні фази готуються за допомогою бінарної та потрійної рухомих фаз, показаних на рисунку Template:index. Коли ми вивчаємо хроматограми з цих семи мобільних фаз, ми можемо виявити, що одна або кілька забезпечує адекватне поділ, або ми можемо визначити область всередині трикутника розчинника, де можливе поділ. Рисунок Template:index показує карту роздільної здатності для зворотної фази поділу бензойної кислоти, терефталевої кислоти, p -амінобензойної кислоти та p -гідроксибензойної кислоти на неполярній колонці C 18, в якій максимальний бажаний час аналізу встановлено 6 хв [Harvey, D.T.; Байерлі, С.; Боумен, А.; Томлін, Дж. Едук. 1991, 68, 162—168]. Області синього, зеленого та червоного кольорів показують рухомі фазові композиції, які не забезпечують базову роздільну здатність. Незатінена область являє собою рухомі фазові композиції, де можливе поділ.
Вибір для початку з ацетонітрилу є довільним - ми можемо так само легко вибрати, щоб почати з метанолу або з тетрагідрофураном.
| % В/в СН 3 ОН | % в/в СН 3 СН | % в/в ТГФ |
|---|---|---|
| 0 | 0 | 0 |
| 10 | 6 | 4 |
| 20 | 14 | 10 |
| 30 | 22 | 16 |
| 40 | 32 | 24 |
| 50 | 40 | 30 |
| 6 | 50 | 36 |
| 70 | 60 | 44 |
| 80 | 72 | 52 |
| 90 | 87 | 62 |
| 100 | 99 | 71 |
Вибір мобільної фази: ізократичні та градієнтні елюції
Поділ за допомогою рухомої фази, що має фіксований склад, - це ізократичне елюція. Однією з труднощів з ізкратичним елююванням є те, що відповідна міцність рухомої фази для розчинення ранніх елюючих розчинів може призвести до неприпустимо тривалого часу утримання розчинених речовин, що запізнилися. З іншого боку, оптимізація рухомої фази для розчинів з пізнім елююванням може забезпечити недостатнє відділення розчинів, що рано елютують. Зміна складу рухомої фази в міру прогресування поділу є одним з рішень цієї проблеми. Для розділення зворотної фази ми використовуємо початкову рухливу фазу, яка є більш полярною. У міру поділу ми коригуємо склад рухомої фази так, щоб вона стала менш полярною (див. Рисунок Template:index). Такі поділи називаються градієнтними елюціями.
HPLC Сантехніка
У газовому хроматографі тиску з балона зі стисненим газом достатньо, щоб проштовхнути рухливу фазу через колонку. Проштовхування рідкої рухомої фази через колону, однак, вимагає набагато більше зусиль, створюючи тиск, що перевищує кілька сотень атмосфер. У цьому розділі ми розглянемо основну сантехніку, необхідну для переміщення рухомої фази через колонку і для нагнітання зразка в рухливу фазу.
Переміщення мобільної фази
Типова ВЕРХ включає між 1-4 резервуарами для зберігання рухомих фазових розчинників. Наприклад, прилад на малюнку Template:index} має два рухомих фазових резервуара, які використовуються для ізократичного елюації або градієнтного елюювання шляхом витягування розчинників з одного або обох резервуарів.
Перед використанням розчинника рухомої фази ми повинні видалити розчинені гази, такі як N 2 і O 2, і дрібні тверді частинки, такі як пил. Оскільки на колонці спостерігається велике падіння тиску - тиск на вході в колонку становить цілих кілька сотень атмосфер, але це атмосферний тиск на виході колонки - гази, розчинені в рухомій фазі, виділяються у вигляді бульбашок газу, які можуть перешкоджати реакції детектора. Дегазація здійснюється декількома способами, але найбільш поширеними є використання вакуумного насоса або розпарювання інертним газом, таким як He, який має низьку розчинність в рухомій фазі. Тверді матеріали, які можуть засмітити трубку або колону ВЕРХ, видаляються шляхом фільтрації розчинників.
Барботіння інертного газу через рухливу фазу виділяє летючі розчинені гази. Цей процес називається розпаркуванням.
Розчинники рухомої фази витягуються зі своїх резервуарів під дією одного або декількох насосів. Рисунок Template:index показує макро вигляд насосів для приладу на малюнку Template:index. Робочий насос і врівноважуючий насос мають поршень, рух якого назад і вперед підтримує постійну швидкість потоку до декількох мл/хв і забезпечує високий вихідний тиск, необхідний для проштовхування рухомої фази через хроматографічну колону. У цьому конкретному приладі кожен насос посилає свою рухливу фазу в змішувальну камеру, де вони об'єднуються, утворюючи остаточну рухливу фазу. Відносна швидкість двох насосів визначає кінцевий склад рухомої фази.
Рух назад і вперед зворотно-поступального насоса створює імпульсний потік, який сприяє шуму хроматограми. Щоб мінімізувати ці імпульси, кожен насос на рис. Template:index має два циліндри. Під час прямого ходу робочого циліндра він заповнює врівноважуючий циліндр і встановлює потік через колону. Коли робочий циліндр знаходиться на зворотному ходу, потік підтримується поршнем в урівноважуючому циліндрі. В результаті виходить безімпульсний потік.
Існують і інші можливі способи контролю складу рухомої фази і швидкості потоку. Наприклад, замість двох насосів на малюнку Template:index, ми можемо розмістити дозуючий клапан розчинника перед одним насосом. Значення дозування розчинника з'єднує два або більше резервуарів розчинника з насосом і визначає, скільки кожного розчинника витягується під час кожного з циклів насоса. Інший підхід для усунення імпульсного потоку полягає у включенні імпульсної заслінки між насосом і колоною. Імпульсний демпфер - це камера, наповнена легко стискається рідиною і гнучкою діафрагмою. Під час прямого ходу поршня рідина в імпульсному демпфері стискається. Коли поршень відводиться для заправки насоса, тиск з розширюється рідини в імпульсному демпфері підтримує швидкість потоку.
Ін'єкція зразка
Робочий тиск у ВЕРХ досить високий, що ми не можемо ввести зразок у рухливу фазу, вставивши шприц через перегородку, як це можливо при газовій хроматографії. Замість цього ми вводимо зразок за допомогою інжектора циклу, схема якого показана на малюнку Template:index. У положенні навантаження петля зразка, яка доступна в різних розмірах від 0,5 мкл до 5 мл - ізольована від рухомої фази і відкрита в атмосферу. Петля зразка заповнюється за допомогою шприца ємністю, в кілька разів більшою, ніж петля зразка, при цьому надлишок зразка виходить через відпрацьовану лінію. Після завантаження зразка інжектор повертають в положення упорскування, яке перенаправляє рухому фазу через петлю зразка і на колонку.
Інструмент на малюнку Template:index використовує автосемплер для введення зразків. Замість того, щоб використовувати шприц для проштовхування зразка в петлю зразка, шприц втягує зразок в петлю зразка.
Детектори для ВЕРХ
Багато різних типів детекторів були використані для моніторингу поділу ВЕРХ, більшість з яких використовують спектроскопічні методи з глави 10 або електрохімічні методи з глави 11.
Спектроскопічні детектори
Найпопулярніші детектори ВЕРХ використовують спектр поглинання УФ/Віс аналіта. Ці детектори варіюються від простих конструкцій, в яких аналітична довжина хвилі вибирається за допомогою відповідних фільтрів, до модифікованого спектрофотометра, в якому відсік для зразків включає проточну комірку. Рисунок Template:index показує конструкцію типової проточної комірки при використанні в якості детектора спектрометра діодного масиву. Проточна комірка має об'єм 1-10 мкл і довжину шляху 0,2-1 см.
Щоб переглянути деталі про те, як ми вимірюємо поглинання, див. Розділ 10.2. Більш детальна інформація про різні типи приладів, включаючи спектрометр діодного масиву, знаходиться в розділі 10.3.
При використанні UV/VIS-детектора результуюча хроматограма є графіком поглинання як функції часу елюації (див. Рисунок Template:index). Якщо детектор є спектрометром діодного масиву, то ми також можемо відобразити результат у вигляді тривимірної хроматограми, яка показує поглинання як функцію довжини хвилі та часу елюації. Одне з обмежень використання поглинання полягає в тому, що рухлива фаза не може поглинати на довжині хвиль, які ми хочемо контролювати. У таблиці Template:index наведено мінімальну корисну довжину хвилі УФ для декількох поширених розчинників ВЕРХ. Детектори поглинання забезпечують межі виявлення всього лише 100 pg—1 нг ін'єкційного аналіту.
Якщо аналіт флуоресцентний, ми можемо помістити проточну комірку в спектрофлуориметрі. Як показано на малюнку Template:index, флуоресцентний детектор забезпечує додаткову селективність, оскільки лише деякі компоненти зразка є флуоресцентними. Межі виявлення становлять лише 1—10 пг введеного аналіту.
Див. Розділ 10.6 для огляду флуоресцентної спектроскопії та спектрофлуориметрів.
Електрохімічні детектори
Ще однією поширеною групою детекторів ВЕРХ є детектори, засновані на електрохімічних вимірах, таких як амперометрія, вольтамметрія, кулометрія та провідність. Наприклад, на малюнку Template:index} показано амперометричну клітинку потоку. Стічні води з колони проходять над робочим електродом, утримуваним з постійним потенціалом відносно нижчого еталонного електрода, який повністю окислює або зменшує аналіти. Струм, що протікає між робочим електродом і допоміжним електродом, служить аналітичним сигналом. Межі виявлення для амперометричного електрохімічного виявлення становлять від 10 pg—1 нг введеного аналіту.
Див. Розділ 11.4 для огляду амперометрії.
Інші детектори
Кілька інших детекторів були використані у ВЕРХ. Вимірювання зміни показника заломлення рухомої фази аналогічно моніторингу теплопровідності рухомої фази в газовій хроматографії. Детектор показника заломлення майже універсальний, реагуючи майже на всі сполуки, але має відносно погану межу виявлення 0,1—1 мкг введеного аналіту. Додатковим обмеженням детектора показника заломлення є те, що його не можна використовувати для градієнтного елюювання, якщо мобільні фазові компоненти не мають однакових показників заломлення.
Ще один корисний детектор - мас-спектрометр. На малюнку Template:index показана блок-схема типового приладу HPLC—MS. Стоки з колони надходять у джерело іонів мас-спектрометра за допомогою інтерфейсу, який видаляє більшу частину рухомої фази, що є суттєвою потребою через несумісність між рідкою рухомою фазою та середовищем високого вакууму мас-спектрометра. В іонізаційній камері інші молекули - суміш рухомих фазових компонентів і розчинів - піддаються іонізації та фрагментації. Мас-аналізатор мас-спектрометра відокремлює іони за співвідношенням маси до заряду (м/з). Детектор підраховує іони і відображає масовий спектр.
Існує кілька варіантів моніторингу хроматограми при використанні мас-спектрометра в якості детектора. Найпоширенішим методом є безперервне сканування всього масового спектру та повідомлення про загальний сигнал для всіх іонів, що досягають детектора під час кожного сканування. Це загальне іонне сканування забезпечує універсальне виявлення для всіх аналітів. Як видно на малюнку Template:index, ми можемо досягти певної міри селективності, контролюючи лише конкретні співвідношення маси до заряду, процес, який називається селективно-іонним моніторингом.
Переваги використання мас-спектрометра у ВЕРХ такі ж, як і для газової хроматографії. Межі виявлення дуже хороші, як правило, 0,1—1 нг ін'єкційного аналіту, зі значеннями, як низькі, як 1-10 pg для деяких зразків. Крім того, мас-спектрометр надає якісну, структурну інформацію, яка може допомогти ідентифікувати аналіти. Інтерфейс між ВЕРХ та мас-спектрометром технічно складніший, ніж у GC-MS через несумісність рідкої рухомої фази з високою вимогою до вакууму мас-спектрометра.
Більш детальну інформацію про мас-спектрометрії див. Вступ до мас-спектрометрії Майкла Саміда та Олуджіде Акінбо, ресурсу, який є частиною цифрової бібліотеки аналітичних наук.
Кількісні програми
Високоефективна рідинна хроматографія використовується як для якісного, так і кількісного аналізу екологічних, фармацевтичних, промислових, криміналістичних, клінічних та споживчих зразків продукції.
Підготовка зразків до аналізу
Зразки в рідкій формі вводять у ВЕРХ після відповідного очищення для видалення будь-яких твердих частинок або після відповідної екстракції для видалення матричних перешкод. При визначенні поліароматичних вуглеводнів (ПАГ) у стічних водах, наприклад, екстракція з CH 2 Cl 2 служить подвійному призначенню концентрування аналітів і виділення їх від матричних втручань. Тверді зразки спочатку розчиняють у відповідному розчиннику або аналітах, що представляють інтерес, вносяться в розчин шляхом екстракції. Наприклад, аналіз ВЕРХ для активних інгредієнтів та продуктів розпаду у фармацевтичній таблетці часто починається з вилучення порошкоподібної таблетки з частиною рухомої фази. Зразки газу збирають шляхом барботирования їх через пастку, яка містить відповідний розчинник. Органічні ізоціанати в промислових атмосферах збирають шляхом барботирования повітря через розчин 1- (2-метоксифеніл) піперазину в толуолі. Реакція між ізоціанатами та 1- (2-метоксифеніл) піперазином стабілізує їх проти деградації перед аналізом ВЕРХ і перетворює їх у хімічну форму, яку можна контролювати за допомогою поглинання УФ.
Кількісні розрахунки
Кількісний аналіз ВЕРХ часто простіший, ніж кількісний аналіз ГХ, оскільки петля зразка фіксованого обсягу забезпечує більш точну та точну ін'єкцію. Як результат, більшість кількісних методів ВЕРХ не потребують внутрішнього стандарту і замість цього використовують зовнішні стандарти і нормальну калібрувальну криву.
Внутрішній стандарт необхідний при використанні HPLC-MS, оскільки інтерфейс між ВЕРХ та мас-спектрометром не дозволяє відтворювати передачу елюенту колонки в іонізаційну камеру MS.
Концентрацію поліядерних ароматичних вуглеводнів (ПАГ) у ґрунті визначають шляхом першого вилучення ПАУ метиленхлоридом. Екстракт розбавляється, якщо це необхідно, і ПАУ відокремлюють за допомогою ВЕРХ за допомогою УФ/ВІС або флуоресцентного детектора. Калібрування досягається за допомогою одного або декількох зовнішніх стандартів. У типовому аналізі 2,013-г зразка висушеного ґрунту екстрагують 20,00 мл хлориду метилену. Після фільтрування для видалення грунту видаляють 1,00-мл порцію екстракту і розводять до 10,00 мл ацетонітрилом. Введення 5 мкл розведеного екстракту в ВЕРХ дає сигнал 0,217 (довільні одиниці) для фторантену ПАГ. При аналізі 5 мкл стандарту фторантену 20,0-ppm з використанням тих же умов вимірюється сигнал 0,258. Повідомити частини на мільйон фторантену в грунті.
Рішення
Для одноточкового зовнішнього стандарту взаємозв'язок між сигналом, S, і концентрацією, С, флуорантену становить
\[S = kC \nonumber\]
Підстановка в значеннях сигналу і концентрації стандарту дає значення k як
\[k=\frac{S}{C}=\frac{0.258}{20.0 \text{ ppm}}=0.0129 \text{ ppm}^{-1} \nonumber\]
Використовуючи це значення для k та сигналу ВЕРХ зразка, дає концентрацію фторантену
\[C=\frac{S}{k}=\frac{0.217}{0.0129 \text{ ppm}^{-1}}=16.8 \text{ ppm} \nonumber\]
для витягнутого і розведеного зразка грунту. Концентрація фторантену в грунті становить
\[\frac{16.8 \text{ g} / \mathrm{mL} \times \frac{10.00 \text{ mL}}{1.00 \text{ mL}} \times 20.00 \text{ mL}}{2.013 \text{ g} \text { sample }}=1670 \text{ ppm} \text { fluoranthene } \nonumber\]
Концентрацію кофеїну в напоях визначають шляхом зворотно-фазового поділу ВЕРХ з використанням рухомої фази 20% ацетонітрилу і 80% води, і за допомогою неполярної колонки С 8. Результати для серії 10-мкл ін'єкцій стандартів кофеїну наведені в наступній таблиці.
| [Кофеїн] (мг/л) | пікова площа (арб. одиниць) |
|---|---|
| 50.0 | 226724 |
| 100.0 | 453762 |
| 125.0 | 559443 |
| 250.0 | 1093637 |
Яка концентрація кофеїну в зразку, якщо ін'єкція 10-мкл дає пікову площу 424195? Дані в цій проблемі походять від Kusch, P.; Knupp, G. «Одночасне визначення кофеїну в напоях Cola та інших напоях за допомогою реверсивної фази HPTLC та ВЕРХ зворотної фази», Chem. Педагог, 2003, 8, 201—205.
- Відповідь
-
На малюнку нижче показана калібрувальна крива і рівняння калібрування для набору зовнішніх стандартів. Заміна пікової площі зразка в калібрувальне рівняння дає концентрацію кофеїну в зразку 94,4 мг/л.
Найкращий спосіб оцінити теоретичні та практичні деталі, розглянуті в цьому розділі, - це уважно вивчити типовий аналітичний метод. Хоча кожен метод унікальний, наступний опис визначення флуоксетину в сироватці є повчальним прикладом типової процедури. Опис тут базується на Сміт, В.Ф. Аналітична хімія складних матриць, Wiley Teubner: Chichester, Англія, 1996, pp. 187—189.
Представницький метод 12.5.1: Визначення флуоксетину в сироватці крові
Опис методу
Флуоксетин - ще одна назва антидепресантного препарату Прозак. Визначення флуоксетину в сироватці крові є важливою складовою контролю за її терапевтичним застосуванням. Аналіз ускладнюється складною матрицею зразків сироватки крові. Твердофазне видобуток з подальшим аналізом ВЕРХ за допомогою флуоресцентного детектора забезпечує необхідну селективність та межі виявлення.
Порядок дій
Додайте відому кількість антидепресанту протриптиліну, який служить внутрішнім стандартом, до кожного зразка сироватки та до кожного зовнішнього стандарту. Щоб видалити матричні перешкоди, пропустіть 0,5-мл аліквоту кожного зразка сироватки або стандарт через картридж твердофазної екстракції С 18. Після промивання картриджа для видалення перешкод елітуйте інші складові, включаючи аналіт і внутрішній стандарт, промивши картридж 0,25 мл 25:75 в/в суміші 0,1 М HClO 4 і ацетонітрилу. Введіть аліквоту 20-мкл на 15-см\(\times\) 4,6-мм колонку, упаковану стаціонарною фазою 5 мкм C 8. Ізкратична рухлива фаза становить 37, 5:62 ,5 в/в ацетонітрилу і води (яка містить 1,5 г перхлорату тетраметиламонію і 0,1 мл 70% в/в HClO 4). Контролюйте хроматограму за допомогою флуоресцентного детектора, встановленого на довжину хвилі збудження 235 нм і довжину хвилі випромінювання 310 нм.
Запитання
1. Тверда фаза екстракції важлива, оскільки вона видаляє конституції в сироватці крові, які можуть перешкоджати аналізу. Які види перешкод можливі?
Сироватка крові, яка являє собою складну суміш сполук, становить приблизно 92% води, 6— 8% розчинних білків і менше 1% кожна з різних солей, ліпідів і глюкози. Безпосереднє введення сироватки не доцільно з трьох причин. По-перше, будь-які тверді частинки в сироватці будуть засмічувати колону і обмежувати потік рухомої фази. По-друге, деякі сполуки в сироватці крові можуть занадто сильно вбиратися до стаціонарної фази, погіршуючи продуктивність колонки. Нарешті, хоча ВЕРХ може розділяти та аналізувати складні суміші, аналіз є складним, якщо кількість складових перевищує пікову потужність колони.
2. Однією з переваг аналізу ВЕРХ є те, що контурний інжектор часто усуває необхідність внутрішнього стандарту. Чому в цьому аналізі використовується внутрішній стандарт? Яке припущення (и) ми повинні зробити при використанні внутрішнього стандарту?
Внутрішній стандарт необхідний через невизначеності, введеної під час твердофазної екстракції. Наприклад, обсяг сироватки, переданої в твердофазний екстракційний картридж, 0,5 мл, і обсяг розчинника, який використовується для видалення аналіту та внутрішнього стандарту, 0,25 мл, дуже малі. Точність і точність, з якою ми можемо виміряти ці обсяги, не такі хороші, як коли ми використовуємо більші обсяги. Наприклад, якщо ми витягуємо аналіт в об'ємі 0,24 мл замість обсягу 0,25 мл, то концентрація аналіта збільшується трохи більше ніж на 4%. Крім того, концентрація елюйованих аналітів може варіюватися від випробування до випробування через зміни кількості розчину, що утримується картриджем. Використання внутрішнього стандарту компенсує ці варіації. Щоб бути корисним, ми повинні припустити, що аналіт і внутрішній стандарт повністю зберігаються під час початкового завантаження, що вони не втрачаються при промиванні картриджа, і що вони витягуються повністю під час остаточного елюювання.
3. Чому процедура контролює флуоресценцію замість контролю поглинання УФ?
Флуоресценція є більш селективним методом виявлення аналітів. Багато інших зазвичай призначаються антидепресанти (і їх метаболіти) виділяють час утримання, подібний до часу флуоксетину. Ці сполуки, однак, або не флуоресцентні, або є лише слабо флуоресцентними.
4. Якщо піки для флуоксетину та протриптиліну вирішені недостатньо, як ви можете змінити рухливу фазу, щоб поліпшити їх поділ?
Зменшення кількості ацетонітрилу та збільшення кількості води в мобільному збільшить час утримання, надаючи більше часу для поділу.
Оцінка
За кількома винятками, масштаб роботи, точність, точність, чутливість, селективність, час аналізу та вартість методу ВЕРХ аналогічні методам GC. Обсяги впорскування для методу ВЕРХ зазвичай більші, ніж для методу GC, оскільки колонки ВЕРХ мають більшу ємність. Оскільки він використовує ін'єкцію петлі, точність методу ВЕРХ часто краща, ніж метод GC. ВЕРХ не обмежується летючими аналітами, а це означає, що ми можемо аналізувати більш широкий спектр сполук. Капілярні колонки ГК, з іншого боку, мають більше теоретичних пластин і можуть розділяти більш складні суміші.