12.3: Оптимізація хроматографічних поділів

Тепер, коли ми визначили коефіцієнт утримання розчиненої речовини, селективність та ефективність стовпців, ми можемо розглянути, як вони впливають на роздільну здатність двох тісно елюючих піків. Оскільки два піки мають однаковий час утримання, розумно припустити, що їх пікова ширина майже однакова. Якщо кількість теоретичних пластин однакова для всіх розв'язків - не строго вірно, але не погане припущення - то з рівняння 12.2.15 співвідношення t _r/w є постійною. Якщо два розчинених речовини мають однакові терміни утримання, то їх пікова ширина повинна бути однаковою. Рівняння 12.2.1, отже, стає

\[R_{A B}=\frac{t_{r, B}-t_{r, A}}{0.5\left(w_{B}+w_{A}\right)} \approx \frac{t_{r, B}-t_{r, A}}{0.5\left(2 w_{B}\right)}=\frac{t_{r, B}-t_{r, A}}{w_{B}} \label{12.1}\]

де B - пізніша елюація двох розчинених речовин. Розв'язування рівняння 12.2.15 для w _B і підстановка в Equation\ ref {12.1} залишає нам наступний результат.

\[R_{A B}=\frac{\sqrt{N_{B}}}{4} \times \frac{t_{r, B}-t_{r, A}}{t_{r, B}} \label{12.2}\]

Перевпорядкування рівняння 12.2.8 надає нам наступні рівняння для часу утримання розчинених речовин A і B.

\[t_{r, A}=k_{A} t_{\mathrm{m}}+t_{\mathrm{m}} \quad \text { and } \quad t_{\mathrm{r}, B}=k_{B} t_{\mathrm{m}}+t_{\mathrm{m}} \nonumber\]

Після підстановки цих рівнянь в Equation\ ref {12.2} і спрощення, ми маємо

\[R_{A B}=\frac{\sqrt{N_{B}}}{4} \times \frac{k_{B}-k_{A}}{1+k_{B}} \nonumber\]

Нарешті, ми можемо усунути коефіцієнт утримання розчиненої речовини А шляхом підстановки в рівнянні 12.2.9. Після перестановки ми отримуємо наступне рівняння роздільної здатності між хроматографічними піками для розчинених речовин A та B.

\[R_{A B}=\frac{\sqrt{N_{B}}}{4} \times \frac{\alpha-1}{\alpha} \times \frac{k_{B}}{1+k_{B}} \label{12.3}\]

На додаток до роздільної здатності, ще одним важливим фактором хроматографії є кількість часу, необхідного для виділення пари розчинених речовин, які ми можемо наблизити, використовуючи час утримання розчиненої речовини B.

\[t_{r, s}=\frac{16 R_{AB}^{2} H}{u} \times\left(\frac{\alpha}{\alpha-1}\right)^{2} \times \frac{\left(1+k_{B}\right)^{3}}{k_{B}^{2}} \label{12.4}\]

де u - швидкість рухомої фази.

Хоча Equation\ ref {12.3} корисно для розгляду того\(\alpha\), як зміна N або k якісно впливає на роздільну здатність - що відповідає нашій меті тут, вона менш корисна для точних кількісних прогнозів роздільної здатності, особливо для менших значень N і для більших значень R. Для більш точних прогнозів використовуйте рівняння

\[R_{A B}=\frac{\sqrt{N}}{4} \times(\alpha-1) \times \frac{k_{B}}{1+k_{\mathrm{avg}}} \nonumber\]

де k _{середнє} дорівнює (k _A + k _B) /2. Для виведення цього рівняння та для більш глибокого обговорення роздільної здатності в колоновій хроматографії див Фолі, Дж. П. «Рівняння роздільної здатності для колоночної хроматографії», Аналітик, 1991, 116, 1275-1279.

Рівняння\ ref {12.3} та Equation\ ref {12.4} містять терміни, які відповідають ефективності стовпця, селективності та коефіцієнту утримання розчиненої речовини. Ми можемо варіювати ці терміни більш-менш незалежно, щоб покращити час роздільної здатності та аналізу. Перший член, який є функцією кількості теоретичних пластин (для Equation\ ref {12.3}) або висоти теоретичної пластини (для Equation\ ref {12.4}), враховує ефект ефективності колони. Другий термін є функцією\(\alpha\) і враховує вплив вибірковості стовпців. Нарешті, третій член в обох рівняннях є функцією k _B і враховує вплив коефіцієнта утримання розчиненої речовини B. Обговорення того, як ми можемо використовувати ці параметри для покращення роздільної здатності, є предметом решти цього розділу.

Використання коефіцієнта збереження для оптимізації роздільної здатності

Одним з найпростіших способів поліпшення роздільної здатності є регулювання коефіцієнта утримання для розчиненої речовини B. Якщо всі інші члени в Equation\ ref {12.3} залишаються постійними, збільшення k _B покращить роздільну здатність. Як показує зелена крива на малюнку Template:index, однак, покращення є найбільшим, якщо початкове значення k _B невелике. Після того, як k _B перевищує значення приблизно 10, подальше збільшення дає лише незначне поліпшення роздільної здатності. Наприклад, якщо початкове значення k _B дорівнює 1, збільшення його значення до 10 дає 82% поліпшення роздільної здатності; подальше збільшення до 15 забезпечує чисте поліпшення роздільної здатності лише 87,5%.

Рисунок Template:index. Вплив k _B на роздільну здатність для пари розчинених речовин, R _AB, і час утримання для пізнішої розчиненої речовини, t _{r, B}. Y -осі відображають роздільну здатність і час утримання відносно їх відповідних значень, коли k _B дорівнює 1,00.

Будь-яке поліпшення роздільної здатності від збільшення значення k _B, як правило, відбувається за рахунок більш тривалого часу аналізу. Червона крива на малюнку Template:index показує відносну зміну часу утримання розчиненої речовини B в залежності від його коефіцієнта утримання. Зверніть увагу, що мінімальний час утримання становить для k _B = 2. Збільшення k _B від 2 до 10, наприклад, приблизно подвоює час утримання розчиненої речовини В.

Зв'язок між коефіцієнтом збереження та часом аналізу на малюнку Template:index працює на нашу користь, якщо поділ дає прийнятну роздільну здатність з великим k _B. У цьому випадку ми можемо зменшити k _B з невеликими втратами роздільної здатності та зі значно коротшим часом аналізу.

Щоб збільшити k _B без зміни селективності\(\alpha\), будь-яка зміна хроматографічних умов повинна призвести до загального, неселективного збільшення коефіцієнта утримання для обох розчинених речовин. У газовій хроматографії ми можемо досягти цього, зменшивши температуру колонки. Оскільки тиск пари розчиненої речовини менший при більш низьких температурах, він витрачає більше часу в стаціонарній фазі і займає більше часу для елюції. У рідинній хроматографії найпростіший спосіб збільшити коефіцієнт утримання розчиненої речовини - використовувати рухливу фазу, яка є слабшим розчинником. Коли рухлива фаза має меншу міцність розчинника, розчинені речовини проводять пропорційно більше часу в стаціонарній фазі і займають більше часу, щоб елютувати.

Регулювання коефіцієнта утримання для поліпшення роздільної здатності між однією парою розчинених речовин може призвести до неприпустимо тривалого часу утримання для інших розчинених речовин. Наприклад, припустимо, нам потрібно проаналізувати чотирикомпонентну суміш з базовою роздільною здатністю і з часом виконання менше 20 хв. Наш початковий вибір умов дає хроматограму на малюнку Template:index a. Хоча ми успішно відокремлюємо компоненти 3 і 4 протягом 15 хвилин, ми не можемо розділити компоненти 1 і 2. Налаштування умов для покращення роздільної здатності для перших двох компонентів шляхом збільшення k ₂ забезпечує хороше розділення всіх чотирьох компонентів, але час виконання занадто довгий (Рисунок Template:index b). Ця проблема пошуку єдиного набору прийнятних умов експлуатації відома як загальна проблема елюції.

Рисунок Template:index. Приклад, що показує загальну проблему елюції в хроматографії. Докладніше див. Текст.

Одним з рішень загальної проблеми елюції є внесення додаткових коректив до коефіцієнта утримання, коли відбувається поділ. На початку поділу ми встановили початкові хроматографічні умови для оптимізації роздільної здатності для раннього елюювання розчинених речовин. У міру поділу ми коригуємо хроматографічні умови, щоб зменшити коефіцієнт утримання - і, отже, зменшити час утримання - для кожного з пізніших розчинних речовин (Рисунок Template:index c). У газовій хроматографії це досягається за допомогою програмування температури. Початкова температура колонки вибирається таким чином, щоб перші розчинені речовини до елюту дозволилися повністю. Потім температуру підвищують безперервно або поетапно, щоб вивести пізніше елюючі компоненти як з прийнятною роздільною здатністю, так і з розумним часом аналізу. При рідинної хроматографії такий же ефект отримують за рахунок збільшення елюючої міцності розчинника. Це відоме як градієнтне елюція. Про кожне з них ми будемо більше сказати в наступних розділах цієї глави.

Використання вибірковості для оптимізації роздільної здатності

Другий підхід до поліпшення роздільної здатності полягає в коригуванні вибірковості,\(\alpha\). Насправді, для\(\alpha \approx 1\) зазвичай неможливо поліпшити роздільну здатність, регулюючи коефіцієнт утримання розчиненої речовини, k _B, або ефективність колонки, N. Зміна\(\alpha\) часто має більш драматичний вплив на роздільну здатність, ніж зміна k _B. Наприклад, зміна\(\alpha\) від 1.1 до 1,5, утримуючи при цьому постійні всі інші терміни, покращує роздільну здатність на 267%. У газовій хроматографії ми коригуємо,\(\alpha\) змінюючи стаціонарну фазу; в рідинної хроматографії змінюємо склад рухомої фази для регулювання\(\alpha\).

Щоб змінити,\(\alpha\) нам потрібно вибірково коригувати окремі фактори утримання розчинених речовин. На малюнку Template:index показано один з можливих підходів для рідинного хроматографічного поділу суміші заміщених бензойних кислот. Оскільки час утримання слабкої кислотної форми сполуки та її слабкої базової форми різні, час його утримання буде змінюватися залежно від рН рухомої фази, як показано на малюнку Template:index a. Перетину кривих на малюнку Template:index показують значення рН, де два розчинені речовини співелютуються. Наприклад, при рН 3,8 терефталевої кислоти і р -гідроксибензойної кислоти елют як одиночний хроматографічний пік.

Рисунок Template:index. Приклад, що показує, як рН рухомої фази в рідинній хроматографії впливає на селективність: (а) час утримання чотирьох заміщених бензойних кислот як функція рН рухомої фази; (б) значення альфа для трьох пар розчинених речовин, які важко відокремити. Докладніше див. Текст. Рухлива фаза - це буфер оцтової кислоти/ацетату натрію, а стаціонарна фаза - неполярний вуглеводень. Дані Харві, D.T.; Byerly, S; Bowman, A; Tomlin, J. «Оптимізація поділу ВЕРХ та GC за допомогою поверхонь відгуку», J. Chem. Едук. 1991, 68, 162—168.

Рисунок Template:index a показує, що існує багато значень рН, де можливе певне поділ. Щоб знайти оптимальний поділ, намічаємо a для кожної пари розчинених речовин. Червона, зелена та помаранчева криві на малюнку Template:index b показують зміну a з рН для трьох пар розчинених речовин, які найважче розділити (для всіх інших пар розчинених речовин\(\alpha\) > 2 на всіх рівнях рН). Синє затінення показує вікна значень рН, в яких можливо принаймні часткове розділення - цю цифру іноді називають віконною діаграмою - і найвища точка в кожному вікні дає оптимальний рН в цьому діапазоні. Кращим загальним поділом є найвища точка в будь-якому вікні, яка, наприклад, становить рН 3,5. Оскільки час аналізу при цьому рН перевищує 40 хв (рис. Template:index a), вибір рН між 4.1—4.4 може призвести до прийнятного поділу з набагато коротшим часом аналізу.

Давайте використаємо бензойну кислоту, C ₆ H ₅ COOH, щоб пояснити, чому рН може впливати на час утримання розчиненої речовини. При поділі використовується водна рухлива фаза і неполярна стаціонарна фаза. При більш низьких рН бензойна кислота переважає в своїй слабкій кислотній формі, С ₆ Н _{5 СООН}, і легко переходить в неполярну стаціонарну фазу. При більш основних рН, однак, бензойна кислота знаходиться в слабкій формі основи, C ₆ H ₅ COO ^—. Оскільки він тепер несе заряд, його розчинність у рухомій фазі збільшується, а розчинність у неполярній стаціонарній фазі зменшується. Як результат, він проводить більше часу в мобільній фазі і має менший час утримання.

_{Хоча звичайним способом регулювання рН є зміна концентрації буферних агентів, також можна регулювати рН, змінюючи температуру колонки, оскільки значення p K розчиненої речовини залежить від рН; для огляду див. Gagliardi, L. G; Tascon, M; Castells, C B «Ефект} Температура на кислотно-основи рівноваги в методах поділу: огляд,» Анальний. Чим. Акт., 2015. — С. 889, 35—57.

Використання ефективності стовпців для оптимізації роздільної здатності

Третій підхід до поліпшення роздільної здатності полягає в регулюванні ККД колонки за рахунок збільшення кількості теоретичних пластин, N. Якщо у нас є значення для k _B і\(\alpha\), то ми можемо використовувати Equation\ ref {12.3} для обчислення кількості теоретичних пластин для будь-якої роздільної здатності. Таблиця Template:index містить деякі репрезентативні значення. Наприклад, якщо\(\alpha\) = 1,05 і k _B = 2.0, то дозвіл 1,25 вимагає приблизно 24 800 теоретичних пластин. Якщо наша колонка передбачає всього 12 400 пластин, половина від того, що потрібно, то поділ не представляється можливим. Як ми можемо подвоїти кількість теоретичних пластин? Найпростіший спосіб - подвоїти довжину стовпця, хоча це також подвоює час аналізу. Кращим підходом є скорочення висоти теоретичної пластини H навпіл, забезпечуючи бажану роздільну здатність без зміни часу аналізу. Ще краще, якщо ми зможемо зменшити H більш ніж на 50%, можливо, можна досягти бажаної роздільної здатності з ще коротшим часом аналізу, також зменшивши k _B або\(\alpha\).

Таблиця Template:index. Мінімальна кількість теоретичних пластин для досягнення бажаної роздільної здатності для обраних значень k _B і\(\alpha\)

	Р АБ = 1,00		Р АБ = 1,25		Р АБ = 1,50
к Б	\(\alpha = 1.05\)	\(\alpha = 1.10\)	\(\alpha = 1.05\)	\(\alpha = 1.10\)	\(\alpha = 1.05\)	\(\alpha = 1.10\)
0,5	63500	17400	99200	27200	143000	39200
1.0	28200	7740	44100	12100	63500	17400
1.5	19600	5380	30600	8400	44100	12100
2.0	15900	4360	24800	6810	35700	9800
3.0	12500	3440	19600	5380	28200	7740
5.0	10200	2790	15900	4360	22900	6270
10.0	8540	2340	13300	3660	19200	5270

Щоб зменшити висоту теоретичної пластини, нам потрібно розуміти експериментальні фактори, які впливають на розширення смуги. Існує кілька теоретичних методів розширення смуг. Ми розглянемо один підхід, який розглядає чотири внески: варіації довжини шляху, поздовжня дифузія, масоперенесення в стаціонарній фазі та масоперенесення в рухомій фазі.

Кілька шляхів: варіації довжини контуру

Оскільки розчинені молекули проходять через колону, вони подорожують шляхами, які відрізняються довжиною. Через цю різницю в довжині шляху дві розчинені молекули, які потрапляють в стовпець одночасно, вийдуть зі стовпця в різний час. Результатом, як показано на рисунку Template:index, є розширення профілю розчиненої речовини на стовпчику. Внесок множинних шляхів у висоту теоретичної пластини, H _p, становить

\[H_{p}=2 \lambda d_{p} \label{12.5}\]

де d _р - середній діаметр пакувального матеріалу твердих частинок і\(\lambda\) є постійною, що відповідає консистенції упаковки. Менший діапазон розмірів частинок і більш послідовна упаковка дають меншу величину для\(\lambda\). Для колони без пакувального матеріалу H _p дорівнює нулю, і немає ніякого внеску в розширення смуги з декількох шляхів.

Рисунок Template:index. Вплив декількох шляхів на розширення смуги розчиненої речовини. Початковий профіль смуги розчину прямокутний. Коли ця смуга рухається через колону, окремі молекули розчинених речовин рухаються різними шляхами, три з яких показані звивистими кольоровими шляхами (фактичні довжини цих шляхів показані прямими стрілками внизу малюнка). Більшість розчинених молекул проїжджають шляхи з довжиною, подібною до тієї, що показана синім кольором, з кількома подорожуючими набагато коротшими шляхами (зеленими) або набагато довшими шляхами (червоний). В результаті профіль смуги розчиненої речовини в кінці колони є ширшим і за формою гаусса.

Непослідовна упаковка створює канали, які дозволяють деяким молекулам розчинених речовин швидко подорожувати по колоні. Він також може створювати кишені, які тимчасово затримують деякі розчинені молекули, сповільнюючи їх прогрес через колону. Більш рівномірна упаковка мінімізує ці проблеми.

поздовжня дифузія

Другий внесок у розширення смуги є результатом поздовжньої дифузії розчиненої речовини в рухомій фазі. Розчинені молекули знаходяться в постійному русі, дифундуючи від областей з більш високою концентрацією розчинених речовин до областей, де концентрація розчиненої речовини менша. Результатом є збільшення ширини смуги розчиненої речовини (Рисунок Template:index). Внесок поздовжньої дифузії в висоту теоретичної пластини, H _d, становить

\[H_{d}=\frac{2 \gamma D_{m}}{u} \label{12.6}\]

де D _m - коефіцієнт дифузії розчиненої речовини в рухомій фазі, u - швидкість рухомої фази і\(\gamma\) є постійною, пов'язаною з ефективністю набивання колони. Зверніть увагу, що вплив H _d на розширення смуги обернено пропорційний швидкості рухомої фази: більша швидкість забезпечує менший час для поздовжньої дифузії. Оскільки коефіцієнт дифузії розчиненої речовини більший у газовій фазі, ніж у рідкій фазі, поздовжня дифузія є більш серйозною проблемою в газовій хроматографії.

Рисунок Template:index. Вплив поздовжньої дифузії на розширення смуги розчиненої речовини. Показано два горизонтальних перерізи через колону та відповідні профілі концентрації проти відстані, причому (а) є більш раннім за часом. Червона стрілка показує напрямок, в якому рухається рухлива фаза.

Масове перенесення

Коли розчинений розчин проходить через колону, він переміщається між рухомою фазою і стаціонарною фазою. Ми називаємо це рух між фазами масоперенесення. Як показано на малюнку Template:index, розширення смуги відбувається, якщо рух розчиненої речовини всередині рухомої фази або всередині стаціонарної фази недостатньо швидкий для підтримки рівноваги в її концентрації між двома фазами. В середньому молекула розчиненої речовини в рухомій фазі рухається вниз по колоні до того, як вона перейде в стаціонарну фазу. З іншого боку, молекула розчиненої речовини в стаціонарній фазі займає більше часу, ніж очікувалося, щоб повернутися в рухливу фазу. Внески масопереносу в стаціонарній фазі, Н _с, і масопереносу в рухомій фазі, Н _м, задаються наступними рівняннями

\[H_{s}=\frac{q k d_{f}^{2}}{(1+k)^{2} D_{s}} u \label{12.7}\]

\[H_{m}=\frac{f n\left(d_{p}^{2}, d_{c}^{2}\right)}{D_{m}} u \label{12.8}\]

де d _f - товщина стаціонарної фази, d _c - діаметр колони, D _s і D _m - коефіцієнти дифузії для розчиненої речовини в стаціонарна фаза і рухлива фаза, k - коефіцієнт утримання розчиненої речовини, а q - постійна, пов'язана з пакувальним матеріалом колони. Хоча точна форма H _m невідома, це функція розміру частинок та діаметра колони. Зверніть увагу, що вплив H _s і H _m на розширення смуги прямо пропорційний швидкості рухомої фази, оскільки менша швидкість забезпечує більше часу для масоперенесення.

Абревіатура fn в Equation\ ref {12.7} означає «є функцією».

Рисунок Template:index. Вплив масопереносу на розширення смуги: (а) Ідеальні рівноважні гаусові профілі для розчиненої речовини в рухомій фазі та в стаціонарній фазі. (b, c) Якщо ми дозволимо смузі розчиненої речовини рухатися на невелику відстань вниз по колоні, рівновага між двома фазами більше не виходить. Червоні стрілки показують рух розчину - те, що ми називаємо масовим перенесенням розчину - від стаціонарної фази до рухомої фази та від рухомої фази до стаціонарної фази. (d) Після відновлення рівноваги смуга розчиненої речовини тепер ширша.

Збираємо все разом

Висота теоретичної пластини - це підсумовування внесків від кожного з термінів, що впливають на розширення смуги.

\[H=H_{p}+H_{d}+H_{s}+H_{m} \label{12.9}\]

Альтернативною формою цього рівняння є рівняння Ван Демтера

\[H=A+\frac{B}{u}+C u \label{12.10}\]

що підкреслює важливість швидкості рухливої фази. У рівнянні ван Дімтера A враховує внесок множинних шляхів (H _p), B/u - внесок поздовжньої дифузії (H _d), а Cu - за сукупний внесок масопереносу в стаціонарній фазі і в рухомій фазі (Н _с і Н _м).

Існують деякі розбіжності щодо найкращого рівняння для опису зв'язку між висотою пластини та рухомою фазовою швидкістю [Hawkes, SJ JJ Chem. Едук. 1983, 60, 393—398]. Крім рівняння Ван Демтера, інші рівняння включають

\[H=\frac{B}{u}+\left(C_s+C_{m}\right) u \nonumber\]

де C _s і C _m - терміни масопереносу для стаціонарної фази і рухомої фази і

\[H=A u^{1 / 3}+\frac{B}{u}+C u \nonumber\]

Усі три рівняння та інші були використані для характеристики хроматографічних систем, при цьому жодне рівняння не дає найкращого пояснення у кожному випадку [Кеннеді, Р. Т.; Йоргенсон, Дж. Хім. 1989, 61, 1128—1135].

Щоб збільшити кількість теоретичних пластин без збільшення довжини стовпчика, нам потрібно зменшити один або кілька членів в Equation\ ref {12.9}. Найпростіший спосіб зниження Н - це регулювання швидкості рухливої фази. Для менших швидкостей рухомої фази ефективність колони обмежується поздовжньою дифузією, а для більш високих швидкостей рухомої фази ефективність обмежена двома термінами масоперенесення. Як показано на малюнку Template:index, який використовує рівняння Ван Дімтера, оптимальна рухлива фазова швидкість є мінімальною на графіку H як функції u.

Рисунок Template:index. Графік, що показує залежність між висотою теоретичної пластини, H, і швидкістю рухомої фази, u, на основі рівняння Ван Дімтера.

Решта параметрів, що впливають на терміни в Equation\ ref {12.9}, є функціями властивостей стовпця і пропонують інші можливі підходи до підвищення ефективності стовпців. Наприклад, і H _p, і H _m є функцією розміру частинок, використовуваних для упаковки колони. Зменшення розміру частинок, отже, є ще одним корисним методом для підвищення ефективності.

Більш детальне обговорення способів оцінки якості колонки див. Desmet, G.; Caooter, D.; Broeckhaven, K. «Методи представлення графічних даних для оцінки якості стовпців LC», Anal. Хім. 2015, 87, 8593—8602.

Мабуть, найважливішим прогресом в хроматографічних колонок є розробка відкритих трубчастих, або капілярних колонок. Ці колони мають дуже малі діаметри (d _c ≈ 50-500 мкм) і не містять пакувального матеріалу (d _p = 0). Замість цього внутрішня стінка капілярної колонки покрита тонкою плівкою стаціонарної фази. Висота пластини зменшується, оскільки внесок H з H _p (Equation\ ref {12.5}) зникає і внесок від H _m (Equation\ ref {12.8}) стає меншим. Оскільки колона не містить твердого набивного матеріалу, для переміщення рухомої фази через колону потрібно менше тиску, що дозволяє проводити більш довгі колони. Поєднання довшої колони і меншої висоти для теоретичної плити збільшує кількість теоретичних пластин приблизно на\(100 \times\). Капілярні колонки не позбавлені недоліків. Оскільки вони набагато вужчі, ніж упаковані колони, вони вимагають значно меншої кількості зразка, який може бути важко впорскувати відтворювано. Іншим підходом до поліпшення роздільної здатності є використання тонких плівок стаціонарної фази, що зменшує внесок H від H _s (Equation\ ref {12.7}).

Чим менше частинки, тим більший тиск потрібно, щоб проштовхнути рухливу фазу через колонку. В результаті для будь-якої форми хроматографії існує практична межа розміру частинок.