3.9: Генетичні підходи до вивчення неушкодженого та живого мозку

Маркування живого мозку

Через складність мозку ссавців залишається серйозною проблемою розшифрувати закономірності зв'язку, зроблені на нейрони новонароджених та їх, коли вони інтегруються в ланцюги мозку дорослого. З великими досягненнями як молекулярної генетики, так і світлової мікроскопії, наша здатність запитувати не тільки морфологію нейронів, але і молекулярний і клітинний склад окремих нейронів і пов'язаних з ними синаптичних мереж стала можливою.

Можливо, одним з найвпливовіших внесків у сучасну неврологію було використання флуоресцентних білків (ФП) та їх цілеспрямована експресія в живих нейронів мозкової тканини ссавців. Широкий спектр доступних FPS забезпечує постійно розширюється набір інструментів життєво важливих репортерів та тегів експресії генів. Застосування цих білків варіюється від життєво важливих репортерів, виражених по всій цитоплазмі, до субклітинних тегів злиття білка, які разом можуть бути використані для моніторингу процесу інтеграції ланцюга in vivo за допомогою як електрофізіологічних методів, так і флуоресцентної візуалізації.

Крім просто маркування клітин для ідентифікації, було розроблено ряд інших методів для використання життєво важливих властивостей ФП для дослідження властивостей нейронів. Наприклад, суперкліптичний флуорин, який флуоресцентний при нейтральному рН, але гасне при кислому рН, може бути використаний для моніторингу торгівлі та обміну внутрішньоклітинних відсіків всередині нейронів. Цей варіант дозволяє безпосередньо візуалізувати мембранну динаміку, екзоцитоз і ендоцитоз синаптичних рецепторів, а також вивільнення нейромедіаторів in vitro і in vivo. Зовсім недавно новий метод під назвою відновлення GFP у синаптичних партнерів (GRASP) показує перспективність виявлення синаптичних взаємодій між контактними нейронами. За допомогою прив'язки розщеплених фрагментів GFP для розділення до- і постсинаптичних білків можна спостерігати відновлення флуоресценції GFP, коли генетично цільові клітини утворюють синаптичні пари. Хоча ця технологія успішно застосовується для виявлення безхребетних синапсів, вона ще не була продемонстрована у гризунів (Gordon and Scott, 2009).

Діапазон репортерів FP для візуалізації морфології нейронів, клітинної динаміки та функції синапсу продовжує розширюватися. Однак, мабуть, єдиним обмежуючим фактором для використання ФП у неврології є наші неповні знання про регуляцію генів нейронів. Часто трансгенні репортери не можуть рекапітулювати ендогенні моделі експресії генів, або такі закономірності занадто широкі, щоб ідентифікувати нейрональні підтипи з клітинною точністю.

Транс-синаптичний ланцюг трасування

Основною метою розуміння механізмів розвитку нейронів, формування синапсу та підключення ланцюгів було з'ясування вузлів та закономірностей синаптичної зв'язності. Творчим кутом для вирішення цієї проблеми стало включення генів, що кодують білки FP та FP-Fusion, у нейротропні вірусні вектори, які показують вроджену здатність заражати нейрони та транс-синаптично поширюватися по нервовій системі (Kuypers and Ugolini, 1990; Келлауей, 2008).

Два типи вірусів, які широко використовуються для цієї мети, включають сказ та герпес. Віруси герпесу відносяться до сімейства дволанцюгових ДНК-вірусів, в той час як сказ відноситься до сімейства негативно-ниткових РНК-вірусів (Voyles, 1993). Хоча еволюційно різні, вони обидва наділені унікальною здатністю зв'язуватися з нейрональними клітинами та інфікувати їх. Ця інфекційність, специфічна для типу клітин, надається вірусам через їх зрілі оболонкові частинки, які складаються як з мембрани господаря, так і з вірусно закодованих глікопротеїнів. Композитні білки-оболонки є детермінантами, які опосередковують розпізнавання мембрани нейронів та подальшу інфекцію нейрон-нейрон шляхом зв'язування з рецепторами поверхні мембрани.

Віруси герпесу використовуються для маркування нейронних ланцюгів протягом багатьох років. Двома поширеними штамами відстеження є вірус простого герпесу-1 (ВПГ-1; Lilley et al., 2001) та вірус псевдорабії (PRV; Enquist, 2002). Обидва ці варіанти переважно поширюються в ретроградному напрямку, і кожен був ефективно застосований для розсічення синапсу та ланцюгових з'єднань у мозку гризунів (Callaway, 2008). Однак одним з обмежень використання вірусів герпесу для аналізу ланцюгів є полісинаптичне поширення. Через велику когорту типів клітин в тканині мозку, кількості синапсів, що утворюються на кожній з цих клітин, і високий ступінь взаємозв'язності в інтактних нейронних ланцюгах, цей підхід все ще створює проблему для розсічення точних закономірностей нейронної зв'язності. Щоб спростити аналіз транс-синаптичних схем, Wickersham et al. (2007b) розробили розумну стратегію комплементації білків пальто, яка дозволяє моносинаптичне відстеження нейрональних зв'язків за допомогою псевдотипізованого вірусу сказу (RV). Не плутати з PRV (який, як зазначено вище, насправді є вірусом герпесу), псевдотипування вірусної частинки відноситься до синтетичної модифікації вірусної оболонки, щоб розпізнати чужорідний рецептор, який зазвичай не присутній на мембранах нейронів ссавців. Стратегія буде коротко розглянута нижче, а для подальшого ознайомлення також див. Wickersham et al. (2007a), Аренкіель і Елерс (2009), Hasenstaub and Callaway (2010).

Ген RV, що кодує його глікопротеїн (називається G) був основною мішенню для генетичної модифікації та інженерії векторів RV. Видалення G з генома RV робить вірус як нездатним генерувати інфекційні частинки, так і реплікації некомпетентним. Однак навіть при відсутності гена нативного глікопротеїну RV все ще здатний експресувати свій геном. Таким чином, G можна замінити послідовностями, що кодують FP або біомолекули з тегами FP, щоб генерувати вектори RV для життєво важливого репортерського вираження (Wickersham et al., 2007a). Щоб зробити ці реплікаційні некомпетентні віруси корисними для досліджень трасування схем, вони повинні бути «озброєні», забезпечуючи оболонку в транс шляхом поширення та упаковки частинок in vitro за допомогою клітинних ліній, розроблених для синтезу необхідного глікопротеїну.

Для виконання моносинаптичного трасування ланцюга та цільового FP-експресії RV на бажані нейрональні підмножини, частинки можуть бути спочатку псевдотипізовані з чужорідним білком оболонки EnVA від вірусу лейкозу саркоми птахів, який спеціально зв'язується з класом білків пташиної мембрани, званих рецепторами TVA ( Барнард та ін., 2006). Генетичне націлювання на нейрональні підмножини для експресії TVA спрямовує інфекцію RV лише на ці нейрони. Щоб полегшити моносинаптичне відстеження, Wickersham et al. (2007a) додали розумний поворот у цьому підході. Вводячи плазміду, яка кодує G-білок дикого типу RV, обеззброєний EGFP-експресуючий вірус тепер здатний пройти один раунд подальшого зараження пресинаптичним партнерам нейронів, орієнтованих на ТВА. Оскільки тільки спочатку інфікований нейрон містить G, вірусне поширення припиняється після одного раунду моносинаптичних стрибків. Включаючи плазміду, що кодує червоний FP, дозволяє ідентифікувати клітину, спочатку орієнтовану на інфекцію, серед моносинаптичної мережі клітин, мічених GFP (рис.\(\PageIndex{1}\)). Звичайно, слід враховувати, що справжнє моносинаптичне трасування залежить від націлювання окремих нейронів на експресію G. Якщо, наприклад, синаптично зв'язані клітини обидва мають G, але тільки одна з них служить первинним джерелом TVA-опосередкованої інфекції, то поширення вірусу може стати мультисинаптичним. через наступні раунди вірусної упаковки в пресинаптичних партнерів. Таким чином, контроль моносинаптичного трасування безпосередньо залежить від точності націлювання нейронів для компонентів трасування RV.

Малюнок\(\PageIndex{1}\). Інженерний та псевдотипіруючий вірус сказу (RV) для транснейронального трасування. (A) RV може бути генетично сконструйований для вираження EGFP шляхом заміни геномної послідовності, що кодує білок G пальто. Генетично модифікований мутант G-делеції RV повинен розмножуватися in vitro для постачання білка пальто. Таким чином, частинка може бути псевдотипірована, забезпечуючи чужорідний білок оболонки, такий як EnVA, який походить від вірусу лейкозу птахів і зв'язується конкретно з ним своїм рецептором TVA. Псевдотипізований RV eNVA може бути використаний для вибіркового інфікування нейронів, які були генетично націлені на експресію TVA. Включаючи додаткові конструкції, які кодують білок G-капсиду дикого типу та червону кольорову «клітинну заливку» (B), модифікований RV може бути генетично націлений на окремі нейрони для картографування обмеженого ланцюга та моносинаптичного трасування (C). Оскільки в мозку ссавців для eNVA не існує ендогенних рецепторів, лише нейрони, які запрограмовані на експресію TVA, здатні заражатися псевдотипними віріонами EnVA. Оскільки послідовність G-білка дикого типу була видалена з генома RV, G повинна забезпечуватися комплементацією, щоб забезпечити транс-синаптичне поширення з нейронів, орієнтованих на інфекцію. (D) Поширення вірусу припиняється моносинаптично через відсутність G в немодифікованих нейрональних популяціях.

Ця нова технологія тепер дозволяє розсікати складні закономірності нейронного зв'язку з синаптичною точністю (Stepien et al., 2010; Weible et al., 2010). Орієнтація на дорослі нейрони для відстеження моносинаптичних ланцюгів має певну обіцянку щодо з'ясування чисел, типів та синаптичних входів, які можуть сприяти та/або сприяти формуванню та підтримці інтеграції функціональних схем. Однак, на жаль, багато потрібно дізнатися про вірусні механізми інфекційності, транс-синаптичного поширення та реплікації, щоб зробити методи вірусного відстеження широко застосовними для детального аналізу ланцюга по всій нервовій системі. Наприклад, одним з основних обмежень для вірусно-опосередкованого трасування ланцюга з використанням векторів типу HSV або RV є неминуче погіршення здоров'я нейрональних клітин з часом (Callaway, 2008). У той час як частинки ВПГ демонструють швидкий і високий рівень експресії протягом 1—2 днів, вони також показують фазу реплікації літичного типу, яка індукує втрату нейронів протягом 1-2 тижнів. Хоча більшість нейронів, здається, переносять інфекцію RV протягом більш тривалих періодів часу, вони теж в кінцевому підсумку виявляють ознаки дисфункції та поганого здоров'я після 2 тижнів. Крім того, відомо не так багато про точний тропізм різних вірусів для зараження певних підтипів нейронів. Хоча зрозуміло, що вірусні частинки можуть перетинати аксо-дендритні, дендродендритні, глутаматергічні та ГАБергічні синапси (Willhite et al., 2006; Wickersham et al., 2007b; Stepien et al., 2010; Miyamichi та ін., 2011; Rancz et al., 2011), різні ефективності передачі не визначені. Переважне зв'язування вірусних частинок з різними типами пресинаптичних білків має існувати, що в кінцевому підсумку призведе до більш ефективного перенесення вірусів між певними синаптичними парами. Ця інформація в даний час невідома, тому залишається проблемою надійно виконувати неупереджений кількісний аналіз схем з використанням вірусів протягом тривалого періоду часу.

Хоча сучасні методи трасування транс-синаптичних схем знаходяться в зародковому стані, з подальшим розумінням вірусних механізмів та подальшим «переоснащенням» існуючих векторів, можна легко уявити, що цей експериментальний шлях для інтактного відображення схем стане незамінним. Більше того, ця методологія має певну обіцянку для вирішення невирішених питань у нейрогенезі дорослих, починаючи від ідентифікації типів зв'язків, які динамічно створюються та розриваються під час розробки схеми, до викриття повної когорти вхідних типів, які спостерігаються у зрілих схемах. всередині неушкодженого мозку.

Маніпулювання клітинної та ланцюгової активності

Визначення нейрональних підмножин та пов'язаних з ними мереж було неоціненним для нашого сучасного розуміння морфології нейронів та архітектури схем. Однак, щоб повністю зрозуміти клітинні та молекулярні механізми, які керують утворенням синапсу нейронів у дорослих та інтеграцією ланцюгів, ми повинні мати можливість зондувати нейронну зв'язок. Останні досягнення в генетично кодованих виконавчих механізмах тепер забезпечують таку можливість. Такі технології, як гетерологічний рецептор або експресія каналу, оптогенетика та генетично закодовані синаптичні токсини, починають дозволяти картографувати функціональні схеми з синаптичною точністю (Luo et al., 2008; Arenkiel and Ehlers, 2009; Рисунок \(\PageIndex{3}\)). Націлюючи до- або постсинаптичні типи клітин для маніпуляцій з активністю, в поєднанні з функціональними візуалізаціями та/або електрофізіологічними записами, тепер можна генетично розсікати вузли ланцюга шляхом моніторингу викликаних синтетичних вихідних реакцій. Деякі з найбільш ранніх зусиль з генетичного контролю виходу нейронів покладалися на інженерну експресію гетерологічних рецепторів в нейрони, які зазвичай не показують своєї присутності. Наприклад, експресія модифікованих опіатних рецепторів в мозку трансгенних мишей показала, що введення синтетичних екзогенних лігандів може активувати нейрональні підмножини (Zhao et al., 2003). На сьогоднішній день численні варіації на цю тему виявилися ефективними як для рушійної нервової збудливості, так і для гальмування. Додатковими стратегіями до цих методів є генетична експресія малих молекул для інактивації синаптичної передачі (Karpova et al., 2005), або токсинів, що порушують синаптичну передачу (Harms et al., 2005; Ehlers et al. ін., 2007).

Генетичні стратегії для позначення та маніпулювання нейронами та ланцюгами

Малюнок\(\PageIndex{3}\). (А) Нейрони можуть бути націлені на гетерологічну експресію рецепторів. Ці чужорідні рецептори можуть бути як прямо, так і опосередковано закриті шляхом застосування екзогенних лігандів (зображених у вигляді червоних овалів і фіолетових діамантів). Зліва: гетерологічна активація рецепторів за допомогою застосування синтетичних лігандів може бути використана для зміни іонної рівноваги нейрона і, таким чином, властивостей випалу. Праворуч: залежно від молекулярних властивостей екзогенні ліганди варіативно поширюються по всій тканині мозку. Всі нейрони, що експресують гетерологічні рецептори, здатні активуватися і керувати реакціями клітин мішеней (представлені у вигляді зелених кіл). (B) Експресія світлових каналів може бути використана для модуляції нейрональної стрільби фотонами. Зліва: CHR-2 - неселективний катіонний канал, який оптимально реагує на синє світло. Фотостимулюючий цей канал призводить до позитивних внутрішніх струмів, деполяризації та нейрональної стрільби. NPhR - фотоактивний хлоридний насос, який оптимально реагує на зеленувато-жовте світло. Фотостимулюючий цей протеїн насоса призводить до негативних внутрішніх струмів, гіперполяризації та глушіння нейронів. Праворуч: репортери FP-Fusion можуть бути використані для ідентифікації клітин, які експресують фоточутливі білки (представлені синім забарвленням). Тільки нейрони, що виражають фоточутливі канали та приймають фотони, показують модуляцію, активовану світлом, тоді як цілі нижчих ланцюгів можна контролювати для постсинаптичних фотовідповідей (зелене забарвлення). (C) Цільова експресія синаптичних токсинів у нейроні може бути використана для блокування вивільнення синаптичних бульбашок та інгібування нейротрансмісії до постсинаптичних мішеней. ТТК, правцевий токсин.