Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

3.5: Cre-Lox, лінії водія та специфіка наступного замовлення

  1. Last updated
  2. Save as PDF
  • Page ID
    72961

    • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

    Що таке система CRE-LOX і навіщо вона потрібна?

    У попередніх розділах ми розглянули використання рекомбінантних молекулярних методів, які допомагають нейробіологам зрозуміти роль конкретних нейронів у ланцюзі мозку у складній поведінці. Однак ми ще не вивчали, як забезпечити доставку до конкретних нейронів, щоб переконатися, що конструкція (тобто Chr2, HM3dr або інші конструкції) не експресується неналежним чином в інших типах клітин, ані в інших нейронів. Замість того, щоб покладатися лише на внутрішній механізм клітин, керований промоторами генів, специфічних для клітин, система CRE-LOX часто використовується в неврології. Це потужний метод вибіркового маніпулювання експресією генів у певних підмножині тканин. Є 2 елементи, щоб ця система працювала ефективно; послідовності LOxP, які створюються de novo та наявність Cre-рекомбінази (екзогенної нуклеази). Важливо, що ні фермент нуклеази Cre рекомбінази, ні послідовності LoXp зазвичай не зустрічаються в системах ссавців, тому їх введення не має функціональних наслідків ні для ДНК, ні для нейронів. Генетично розроблені сайти LoXP - це 34 bp послідовності ДНК, які зв'язуються з білком Cre-рекомбінази (і нуклеаза завжди повинна зв'язуватися з 2 LoXP сайтів). Цікаво, що як показано на малюнку\(\PageIndex{1}\), коли сайти LoXP знаходяться в однаковій орієнтації (5' до 3') і Cre-рекомбіназа зв'язується з обома, це призводить до видалення послідовності ДНК між сайтами LoXP, залишаючи один LoXP. Цей тип реакції «флоксирования» відомий як висічення. Якщо сайти LoXP знаходяться в протилежній орієнтації, то послідовність між ними перевернута або «перевернута».

    Різні орієнтації сайтів LoXP навколо послідовності ДНК, що цікавить, спричинить або висічення (видалення ДНК), або інверсію послідовності ДНК.
    Малюнок\(\PageIndex{1}\). Різні орієнтації сайтів LoXP навколо послідовності ДНК, що цікавить, спричинить або висічення (видалення ДНК), або інверсію послідовності ДНК.

    Лінії CRE-драйвера: особливий тип трансгенної миші

    Оскільки Cre-рекомбіназа не впливає на ДНК, крім тих, які містять сайти LoXP (які ніколи не зустрічаються в ДНК ссавців), генерація трансгенних Cre-рекомбіназних моделей миші була логічним кроком у вивченні специфічної експресії генетичних інструментів (оптогенетичних, хемогенетичних або інших) у нейронів. Оскільки різні нейрони мають різні клітинні механізми для активації та експресії певних генів, CRE-рекомбіназа була націлена на конкретні нейрони (або інші типи клітин мозку) з урахуванням цього. Оскільки експресія CRE-рекомбінази була «керована» машиною, специфічною для типу клітин, термін CRE-драйвера лінії став вбудованим у нейробіологію. Як показано на малюнку\(\PageIndex{2}\) нижче, різні типи нейронів, будь то інгібуючі, збудливі чи інші, мають специфічні білки і, отже, гени, які дозволять специфічну експресію екзогенної CRE-рекомбінази. Наприклад, миша TH:: IRES-Cre-рекомбіназа виражає лише CRE-рекомбіназу в межах дофамінергічних нейронів, оскільки TH (тирозингідроксилаза) є синтетичним ферментом, який перетворює амінокислоту тирозину в дофамін в нейрони. У тому ж ключі VGAT: :IRES-CRE-рекомбіназа буде трансгенною лінією миші, яка буде використовуватися для дослідження інгібіторних GABaergic нейронів. Список різних генів/білкових продуктів наведено як на малюнку, так\(\PageIndex{2}\) і в наступній таблиці.

    Диференціальна експресія білків у специфічних групах нейронів, включаючи дофамінергічні, збудливі глутаматергічні та інгібіторні GABaergic типи, що дозволяють спрямовану експресію CRE-рекомбінази в специфічних підмножині нейронів.
    Малюнок\(\PageIndex{2}\). Диференціальна експресія білків у специфічних групах нейронів, включаючи дофамінергічні, збудливі глутаматергічні та інгібіторні GABaergic типи, що дозволяють спрямовану експресію CRE-рекомбінази в специфічних підмножині нейронів.

    Таблиця\(\PageIndex{1}\). Приклади клітин, орієнтованих на Cre-рекомбіназу
    Лінія водія Специфічні типи клітин — Cre-рекомбіназа
    GFAP-Кре Астроцити або нейрональні стовбурові клітини
    Нестін-Кре Нейрональні стовбурові клітини або клітини-попередники
    Клітка Загальний промоутер: всюдисуща експресія у всіх клітині мозку
    Синапсин I-Cre Всі нейрони (всі типи нейронів
    ЕФ1А-Кре Загальний промоутер: всюдисуща експресія у всіх клітині мозку