3.3: Молекулярний набір інструментів - Нейронні схеми (Основи)

Last updated
Save as PDF

Page ID: 72974

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

Ключові виноси

Точне націлювання нейронів
Оптогенетика основи
Канальні родопсини
Інгібуючі опсіни

Точне націлювання нейронів

Нейрони не працюють ізольовано, і вони зазвичай роблять синаптичні зв'язки, що нагадують схеми. Більшість досліджень поведінки та розвитку спиралися на відображення нейронних ланцюгів у мозку та ЦНС. Розуміння зв'язності цих схем дозволяють неврологам зрозуміти поведінку та патології (рис\(\PageIndex{1}\).). У минулому це означало ураження або руйнування частин цих ланцюгів або електрофізіологічне стимулювання цих ланцюгів та вивчення отриманої поведінки. Ці старі методи дозволили нам розсічити детальну роботу нейронних ланцюгів, що лежать в основі природної поведінки, а також дозволили нам зрозуміти, як деякі нейронні ланцюги стають дисфункціональними при захворюваннях, таких як хвороба Паркінсона або епілепсія.

Малюнок\(\PageIndex{1}\): Початок досліджень мозкових ланцюгів у мишей, що використовують оптроди для збудження або пригнічення іонних каналів. Адаптовано з Nature 2016 (відкритий доступ cc на 4).

Мозок хребетних (миші, щури, примати та люди) містить багато різних типів клітин з чіткими молекулярними зразками експресії, фізіологічною активністю та топологічною зв'язністю, які переплітаються у високогетерогенну мережу. Вивчення конкретних груп нейронів у цьому середовищі стає дуже складним завданням, і вчені, які використовують дослідження ураження, стимуляції та відстеження, ніколи не були впевнені в просторовому (тобто були уражені лише конкретні нейрони) та тимчасові (тобто чи можна поразку змінити, що дозволяє змінити поведінку).

Малюнок\(\PageIndex{2}\). Панелі, що узагальнюють особливості збуджуючих, ChR2, (A) та інгібіторних, NPhR, (B) опсинів. Панель С показує, що всі нейрони будуть збудливими за допомогою стандартного електрода. Однак оптогенетичне збудження (синє світло) та інгібування (жовте світло) працюють лише на конкретні нейрони, які виражають відповідний опсин.

Питання щодо специфічності та часової оборотності змінювалися з впровадженням оптогенетики. З кінця 2000-х років оптогенетика відкрила нову еру потужного та цілеспрямованого контролю над багатьма аспектами нервової функції. Генетичні та оптичні методи, що застосовуються разом, дозволяють жорстко просторово та тимчасово контролювати активність конкретних видів нейронів у живому мозку, революційний прогрес, який дозволить нам досягти безпрецедентного розуміння функції нейронних ланцюгів у поведінці тварин. Використовуючи цю методику, нейрони спочатку генно-інженерні (використовуючи різноманітні механізми, описані далі) для експресії світлочутливих білків (опсинів). Коли ці нейрони потім освітлюються світлом правильної частоти, вони будуть тимчасово активовані або гальмуються, або їх сигнальні шляхи будуть модульовані, залежно від конкретного виду опсіну, який був обраний для вираження. Експресія типу клітин зазвичай досягається трансгенними тваринами, вірусними векторами або комбінацією, а просторово обмежене застосування світла дозволяє додатково вдосконалювати орієнтацію на конкретні ділянки мозку. Світло може застосовуватися в різних тимчасових візерунках, щоб оптимально впливати на функцію нейронів (дозволяючи експериментальний контроль частоти спайки та розриву, серед інших параметрів), і може бути обмежений конкретними короткими поведінковими періодами обстеження.

Малюнок\(\PageIndex{3}\). Панель А, що показує збудливий ефект синього світла на мембранно-зв'язаний опсин, що функціонує як канал. Панель B показує потенціали дії у відповідь на синє (збудливе) світло.

Оптогеніка: Основи

Що таке оптогенетичні приводи?

Оптогенетичні виконавчі пристрої - це білки, які змінюють активність клітини, в якій вони виражаються, коли ця клітина піддається впливу світла (рис\(\PageIndex{3}\).). Ці виконавчі механізми можуть бути використані для індукування одного або декількох потенціалів дії (які можуть бути організовані в регулярні спайкові поїзди або які можуть бути псевдовипадковими з керованою користувачем швидкістю), придушення нейронної активності або модифікації біохімічних сигнальних шляхів, з мілісекундним контролем над часом подій. Найпотужнішими та широко використовуваними приводами є опсіни - природні світлочутливі трансмембранні білки - які містяться в різних організмах, починаючи від мікробів і закінчуючи приматами, і які можуть бути використані, як це є в природі або розроблені для оптимізації функціонування. Природні опсіни можуть бути широко класифіковані на два основні класи: мікробні опсіни (тип I) та хребетні опсіни (тип II). Опсини I типу містяться в прокаріотичних та еукаріотичних мікробних організмах, включаючи бактерії, археї та водорості, і складаються з одного мембранно-зв'язаного білкового компонента, який функціонує як насос або канал. Ці опсіни використовуються мікроорганізмами-господарями для різних функцій, включаючи навігацію до джерел енергії та далеко від небезпечних середовищ, а також контролюють внутрішньоклітинні концентрації різноманітних іонів та биття джгутиків.

Опсини типу I були використані в перших оптогенетичних експериментах для контролю функції нейронів, як через простоту генної інженерії з використанням одного компонента білка, так і через їх більш швидку кінетику, і залишаються основним (але не ексклюзивним) джерелом для нових природних і інженерних опсинів.

Малюнок\(\PageIndex{4}\). Опсіни - це мембранно-зв'язані білки, які активуються світлом, що призводить до активації клітин (деполяризації), інгібування (гіперполяризації) або модуляції внутрішньоклітинних сигнальних каскадів (панель А). Тут ілюстровані ChR2 (катіонний канал, який використовується для стимуляції нейронної активності), iC1C2 (нещодавно розроблений хлоридний канал, який використовується для пригнічення нейронної активності), enPHr3.0 (хлоридний насос, який використовується для інгібування нейронної активності), eBR (протонний насос, який використовується для інгібування нервової активності) та OptoXR (рецептор, пов'язаний з білком G для модуляції внутрішньоклітинних сигнальних каскадів). (Панель B) Клітинні та цільноклітинні записи з нейрона, що виражає як ChR2, так і NphR. Зверніть увагу, що окремі шипи можуть бути виявлені коротким імпульсом синього світла (який активує ChR2) і що ці шипи можуть бути заблоковані безперервним жовтим світлом (що активує nPhR). Панель А адаптована з дозволу Fenno et al., 2011, і панель B адаптована з дозволу Чжан та ін., 2007.

Як працюють оптогенетичні приводи?

Опсіни обох типів вимагають сітківки, форми вітаміну А, який ізомеризується при поглинанні фотона, для того, щоб функціонувати. Коли сітківка зв'язується з опсіном, комплекс сітківки опсін стає світлочутливим, і якщо фотон вражає сітківку в такому стані, його результуюча фотоізомеризація призведе до конформаційної зміни опсіна. Це призводить до відкриття каналу або активації насоса, зміни мембранного потенціалу і в кінцевому підсумку активації або гальмування активності нейронів. Тому сітківка повинна бути присутньою для того, щоб оптогенетичні приводи функціонували. На щастя, особливо для ранніх експериментів з доказів принципу, сітківка вже присутня в достатній кількості в нервовій тканині ссавців, щоб дозволити використовувати оптогенетичні інструменти без екзогенних добавок сітківки. Однак безхребетні модельні системи, такі як дрозофіли, потребують добавки сітківки через свій раціон для того, щоб оптогенетичні ефектори функціонували. Тут ми розглядаємо різні класи оптогенетичних приводів, згруповані за їх впливом на нейронну активність або сигналізацію.

Оптогенетична стимуляція нейронної активності: як «увімкнути» нейрони

Канальні родопсини

Channelrhodopsins (CHR) - це світлоізольовані іонні канали, виявлені в Chlamydomonas reinhardtii, одноклітинної зеленої водорості. Перше використання мікробного опсину для контролю шипучої активності нейронів утилізував Channelrhodopsin-2 (ChR2), один з двох каналродопсинів, експресованих цим організмом. ChR2 - це неспецифічний катіонний канал, який при освітленні синім світлом відкривається і дозволяє проходити катіони і подальшу деполяризацію клітини. У 2005 році ChR2 був введений в культивовані нейрони гіпокампа і успішно використовується для контролю спайкової активності з тонкою тимчасовою точністю. Як продемонстрував цей новаторський документ, дуже короткі (мілісекундні) імпульси синього світла можуть бути використані для індукування потенціалів одиночної дії в CHR2-експресивних нейронів, а шипуча активність, керована активацією цього опсіна, може контролюватися з високою точністю на частотах, що наближаються до 30 шипів в секунду.

Оптогенетичне пригнічення активності нейронів: як «вимкнути» нейрони

Хлоридні насоси

Пригнічення нейрональної активності в нейронних ланцюгах може доповнювати збудливі інструменти, дозволяючи дослідникам перевірити роль окремих компонентів нейронального ланцюга. Одним з найбільш ефективних і широко використовуваних оптогенетичних інгібіторних опсинів, NPhR, є галородопсин від археона Natronomonas pharaonis. NPhR перекачує іони хлориду в клітину при довгохвильовій активації світла, що призводить до гіперполяризації. Генна інженерія призвела до серії ревізій, що виробляють enPHr3.0, опсін з поліпшеною локалізацією поверхневої мембрани та більшим фотострумом. З максимумом збудження при 590 нм, enPHr3.0 може керуватися зеленим, жовтим або червоним довжинами хвиль світла, що дозволяє використовувати менш дорогі лазерні системи.

Протонні насоси

Протонні насоси також можуть використовуватися для інгібування нейронів через гіперполяризацію, викачуючи протони з клітини, і мають деякі особливості, які роблять їх бажаними альтернативами хлоридним насосам, які включають швидке відновлення після інактивації та струми більшого розміру після активації. Арка (archaerhodopsin-3 від Halorubrum sodomense), Mac (від гриба Leptosphaeria maculans), АрХТ (архаерходопсин з штаму Halorubrum TP009) та eBR (посилена версія бактеріородопсину з Halobacterium salinarum) - це протонні насоси, які показати надійну ефективність при гальмуванні. Недавня робота продемонструвала, що інгібування нейронів, що експресують ENPHR3.0-експресують, може зробити інгібований нейрон тимчасово більш збудливим завдяки зміщенню хлоридів у потенціалі реверсу рецептора γ-аміномасляної кислоти типу A (GABAA), який може вказувати на інгібітор протонного насоса як варіант вибору для деякі експерименти, особливо за участю цієї системи.

Вправа\(\PageIndex{1}\)

Які опсін функціонує як протонний насос?

Вправа\(\PageIndex{2}\)

Який опсін, коли він виражений, дозволив би збудженню нейрона?

ChR2
НПЧ
0
Жодне з перерахованих вище