Skip to main content
LibreTexts - Ukrayinska

20.1: Практичне застосування моноклональних та поліклональних антитіл

  • Page ID
    3971
  • \( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

    Цілі навчання

    • Порівняйте метод розробки, використання та характеристики моноклональних і поліклональних антитіл
    • Поясніть природу перехресної реактивності антитіл і чому це менше проблеми з моноклональними антитілами

    Клінічна спрямованість: Частина 1

    У нещасному випадку медичний працівник, який бореться з залежністю, був спійманий на крадіжці шприців знеболюючих препаратів і заміні їх шприцами, наповненими невідомими речовинами. Лікарня негайно звільнила працівника і заарештувала його; однак двоє пацієнтів, з якими він працював пізніше, виявили позитивний результат на ВІЛ.

    Хоча не було доказів того, що інфекції виникли від зіпсованих шприців, лікар охорони здоров'я лікарні вжив негайних заходів, щоб визначити, чи піддавалися ризику будь-які інші пацієнти. Хоча працівник був працевлаштований лише протягом короткого часу, було визначено, що він контактував з більш ніж 1300 пацієнтами. Лікарня вирішила зв'язатися з усіма цими пацієнтами і провести їх тестування на ВІЛ.

    Вправа\(\PageIndex{1}\)

    1. Чому лікарня відчуває, що необхідно перевірити кожного пацієнта на ВІЛ?
    2. Які види аналізів можна використовувати, щоб визначити, чи є у пацієнта ВІЛ?

    Окрім того, що вони мають вирішальне значення для нашої нормальної імунної відповіді, антитіла забезпечують потужні інструменти для досліджень та діагностичних цілей. Висока специфічність антитіл робить їх відмінним інструментом для виявлення та кількісної оцінки широкого спектру мішеней, від ліків до білків сироватки крові до мікроорганізмів. За допомогою аналізів in vitro антитіла можуть бути використані для осадження розчинних антигенів, агглютинату (грудочок) клітин, опсонізації та знищення бактерій за допомогою комплементу та нейтралізації ліків, токсинів та вірусів.

    Специфічність антитіл є результатом антигензв'язування сайту, утвореного в межах змінних областей антитіл, які мають унікальні закономірності амінокислот, які можуть зв'язуватися лише з цільовими антигенами з молекулярною послідовністю, яка забезпечує додаткові заряди та нековалентні зв'язки. Однак існують обмеження щодо специфічності антитіл. Деякі антигени настільки хімічно схожі, що виникає перехресна реактивність; іншими словами, антитіла, підняті проти одного антигену, зв'язуються з хімічно подібним, але іншим антигеном. Розглянемо антиген, який складається з одного білка з множинними епітопами (рис.\(\PageIndex{1}\)). Цей єдиний білок може стимулювати вироблення безлічі різних антитіл, деякі з яких можуть зв'язуватися з хімічно ідентичними епітопами на інших білках.

    Перехресна реактивність частіше виникає між антитілами та антигенами, які мають низьку спорідненість або авідність. Спорідненість, яку можна визначити експериментально, є мірою сили зв'язування між місцем зв'язування антитіла та епітопом, тоді як авідність - це загальна сила всіх взаємодій у комплексі антитіло-антиген (який може мати більше одного місця зв'язку). На авідність впливає спорідненість, а також структурні механізми епітопу та змінних областей антитіла. Якщо антитіло має високу споріднення/авідність до конкретного антигену, воно рідше реагує на перехресну реакцію з антигеном, для якого воно має меншу споріднення/авідність.

    Велика структура міченого антигену має різні за формою шматочки, на ній позначені епітопами. Кожен епітоп пов'язаний з антитілом, яке має відповідну кишеню, щоб відповідати формі епітопу.
    Малюнок\(\PageIndex{1}\): Антитіло зв'язується з певною областю на антигені, який називається епітопом. Один антиген може мати кілька епітопів для різних специфічних антитіл.

    Вправа\(\PageIndex{2}\)

    1. Яке властивість робить антитіла корисними для досліджень і клінічної діагностики?
    2. Що таке перехресна реактивність і чому вона виникає

    Продукування поліклональних антитіл

    Антитіла, що використовуються в дослідницьких та діагностичних цілях, часто отримують шляхом ін'єкції лабораторної тварини, такої як кролик або коза зі специфічним антигеном. Протягом декількох тижнів імунна система тварини вироблятиме високий рівень антитіл, специфічних для антигену. Ці антитіла можна збирати в антисироватці, яка являє собою цільну сироватку, зібрану у тварини після впливу антигену. Оскільки більшість антигенів є складними структурами з декількома епітопами, вони призводять до вироблення декількох антитіл у лабораторної тварини. Ця так звана реакція поліклональних антитіл також характерна для відповіді на інфекцію імунною системою людини. Таким чином, антисироватка, отримана від тварини, буде містити антитіла від декількох клонів В-клітин, причому кожна В-клітина реагує на конкретний епітоп на антигені (рис.\(\PageIndex{2}\)).

    Лабораторним тваринам зазвичай вводять принаймні двічі антиген при використанні для виробництва антисироватки. Друга ін'єкція активує клітини пам'яті, які роблять антитіла класу IgG проти антигену. Клітини пам'яті також проходять афінне дозрівання, в результаті чого утворюється пул антитіл з більш високою середньою спорідненістю. Дозрівання спорідненості відбувається через мутації в змінних областях гена імуноглобуліну, в результаті чого в В-клітини зі злегка зміненими антигензв'язуючими сайтами. При повторному впливі антигену ті В-клітини, здатні виробляти антитіла з більш високими афінними антиген-зв'язуючими сайтами, будуть стимулюватися до проліферації та виробляти більше антитіл, ніж їх однолітки з нижчою спорідненістю. Ад'ювант, який є хімічною речовиною, що провокує генералізовану активацію імунної системи, яка стимулює більшу вироблення антитіл, часто змішується з антигеном перед ін'єкцією.

    Антисироватка, отримана від тварин, не тільки містить антитіла проти антигену, штучно введеного в лабораторію, але також буде містити антитіла до будь-яких інших антигенів, яким тварина піддавалася протягом свого життя. З цієї причини антисироватки спочатку повинні бути «очищені» для видалення інших антитіл перед використанням антитіл для досліджень або діагностичних аналізів.

    Діаграма, що показує вироблення поліклональних антитіл. Антиген вводиться тварині (наприклад, кролику). Антиген активує В-клітини. При цьому утворюються клони В-клітин і клони плазматичних клітин. Поліклональні антитіла з різних В-клітин виробляються у відповідь на різні епітопи на антигені. Отримана від тварини сироватка містить поліклональні антитіла.
    Малюнок\(\PageIndex{2}\): Ця діаграма ілюструє процес збору поліклональних антитіл, що виробляються у відповідь на антиген.

    Клінічне використання поліклональних антисироватки

    Поліклональні антисироватки використовуються в багатьох клінічних тестах, які покликані визначити, чи виробляє пацієнт антитіла у відповідь на той чи інший збудник. Хоча ці тести, безумовно, є потужними діагностичними засобами, вони мають свої обмеження, оскільки є непрямим засобом визначення того чи іншого збудника. Тести, засновані на поліклональній відповіді, іноді можуть призвести до хибно-позитивного результату - іншими словами, тесту, який підтверджує наявність антигену, якого насправді немає. Тести на основі антитіл також можуть призвести до помилково негативного результату, який виникає, коли тест не може виявити антитіло, яке насправді є присутнім.

    Точність тестів на антитіла може бути описана з точки зору чутливості тесту та специфічності тесту. Чутливість тесту - це ймовірність отримання позитивного результату тесту, коли пацієнт дійсно інфікований. Якщо тест має високу чутливість, ймовірність помилкового негативу низька. Специфіка тесту, з іншого боку, полягає в ймовірності отримання негативного результату тесту, коли пацієнт не інфікований. Якщо тест має високу специфічність, ймовірність помилкового позитиву низька.

    Помилкові спрацьовування часто виникають внаслідок перехресної реактивності, яка може виникнути, коли епітопи від іншого збудника схожі з тими, що виявляються на збуднику, на який перевіряється. З цієї причини тести на основі антитіл часто використовуються лише як скринінгові тести; якщо результати позитивні, використовуються інші підтверджуючі тести, щоб переконатися, що результати не були хибнопозитивними.

    Наприклад, зразок крові пацієнта, який підозрюється на гепатит С, може бути обстежений на вірус за допомогою антитіл, які зв'язуються з антигенами вірусу гепатиту С. Якщо пацієнт дійсно інфікований вірусом гепатиту С, антитіла зв'яжуться з антигенами, даючи позитивний результат тесту. Якщо пацієнт не інфікований вірусом гепатиту С, антитіла, як правило, ні з чим не зв'язуються, і тест повинен бути негативним; однак помилковий позитив може виникнути, якщо пацієнт був раніше інфікований будь-яким із різноманітних збудників, які викликають антитіла, які перехресно реагують з гепатитом С антигени вірусів. Тести на антитіла до гепатиту С мають високу чутливість (низька ймовірність помилкового негативу), але низьку специфічність (висока ймовірність помилкового позитиву). Таким чином, пацієнти, які мають позитивний тест, повинні мати другий підтверджуючий тест, щоб виключити можливість помилкового позитиву. Підтверджуючий тест - більш дорогий і трудомісткий тест, який безпосередньо перевіряє наявність вірусної РНК гепатиту С в крові. Тільки після того, як підтверджуючий тест повернеться позитивним, пацієнту можна остаточно діагностувати інфекцію гепатиту С. Тести на основі антитіл можуть призвести до помилкового негативу, якщо з якої-небудь причини імунна система пацієнта не виробляла виявлені рівні антитіл. Для деяких захворювань може пройти кілька тижнів після зараження, перш ніж імунна система виробляє достатню кількість антитіл, щоб перетнути поріг виявлення аналізу. У пацієнтів з ослабленим імунітетом імунна система може бути не здатна виробляти виявлений рівень антитіл.

    Ще одне обмеження використання виробництва антитіл як індикатора захворювання полягає в тому, що антитіла в крові будуть зберігатися довго після очищення інфекції. Залежно від типу інфекції антитіла будуть присутні протягом багатьох місяців; іноді вони можуть бути присутніми до кінця життя пацієнта. Таким чином, позитивний тест на основі антитіл означає лише те, що пацієнт був інфікований в певний момент часу; це не доводить, що інфекція активна.

    На додаток до своєї ролі в діагностиці, поліклональні антисироватки можуть активувати комплемент, виявляти присутність бактерій у клінічних умовах та харчової промисловості та виконувати широкий спектр реакцій опадів, які можуть виявляти та кількісно оцінювати сироваткові білки, віруси чи інші антигени. Однак, з урахуванням багатьох особливостей антитіл, присутніх у поліклональній антисироватці, існує значна ймовірність того, що антисироватка буде перехресно реагувати з антигенами, яким людина ніколи не піддавалася впливу. Тому завжди потрібно враховувати можливість хибнопозитивних результатів при роботі з поліклональної антисироваткою.

    Вправа\(\PageIndex{3}\)

    1. Що таке хибнопозитивний і які причини виникають помилкові спрацьовування?
    2. Що таке помилковий негатив і які причини виникають помилкові спрацьовування?
    3. Якщо пацієнт негативно позначається на високочутливому тесті, яка ймовірність того, що людина інфікована збудником?

    Виробництво моноклональних антитіл

    Деякі види аналізів вимагають кращої специфічності та спорідненості антитіл, ніж можна отримати за допомогою поліклональної антисироватки. Щоб досягти цієї високої специфічності, всі антитіла повинні зв'язуватися з високою спорідненістю до одного епітопу. Таку високу специфічність можуть забезпечити моноклональні антитіла (MAB). Таблиця\(\PageIndex{1}\) порівнює деякі важливі характеристики моноклональних і поліклональних антитіл.

    На відміну від поліклональних антитіл, які виробляються у живих тварин, моноклональні антитіла виробляються in vitro за допомогою методів культивування тканин. MAB виробляються шляхом імунізації тварини, часто миші, багаторазово специфічним антигеном. В-клітини з селезінки імунізованого тваринного потім видаляються. Оскільки нормальні В-клітини не здатні розмножуватися назавжди, вони зливаються з безсмертними, раковими В-клітинами, званими клітинами мієломи, щоб отримати гібридомні клітини. Потім всі клітини поміщаються в селективне середовище, яке дозволяє тільки гібридомам рости; невикористані мієломні клітини не можуть рости, і будь-які незмінні В-клітини відмирають. Потім гібридоми, які здатні безперервно рости в культурі, виробляючи антитіла, потім перевіряють на бажаний MaB. Ті, хто виробляє бажаний MaB, вирощують в культурі тканин; культуральне середовище збирають періодично і MaB очищають від середовища. Це дуже дорогий і трудомісткий процес. Може знадобитися тижні культивування та багато літрів середовищ, щоб забезпечити достатню кількість MAB для експерименту або лікування одного пацієнта.\(\PageIndex{3}\)

    Діаграма, що показує вироблення моноклональних антитіл. Антиген вводять тварині (наприклад, миша) клітини селезінки витягуються. Клітини мієломної лінії з культури клітин додаються до клітин селезінки в пробірці. Потім підбирають і вирощують гібридні клітини. Гібридні клітини відокремлюють і дають можливість розмножуватися в клони (гібридоми). Кожен гібрид виробляє різне антитіло і підбирається потрібне антитіло. Потім цю гібридому вирощують для отримання великих партій бажаного MaB.
    Малюнок\(\PageIndex{3}\): Моноклональні антитіла (MAB) виробляються шляхом введення антигену миші, а потім злиття поліклональних В-клітин з селезінки миші до клітин мієломи. Отримані клітини гібридоми культивуються і продовжують виробляти антитіла до антигену. Потім гібридоми, що виробляють бажаний MaB, вирощують у великій кількості на селективному середовищі, яке періодично збирають для отримання бажаних MAB.
    Таблиця\(\PageIndex{1}\): Характеристики поліклональних і моноклональних антитіл
    Моноклональні антитіла Поліклональні антитіла
    Дороге виробництво Недороге виробництво
    Тривалий час виробництва Швидке виробництво
    Велика кількість специфічних антитіл Велика кількість неспецифічних антитіл
    Розпізнати єдиний епітоп на антигені Розпізнайте кілька епітопів на антигені
    Виробництво є безперервним і однорідним після того, як гібридома виготовлена Різні партії розрізняються за складом

    Клінічне використання моноклональних антитіл

    Оскільки найбільш поширені методи отримання моноклональних антитіл використовують клітини миші, необхідно створити гуманізовані моноклональні антитіла для клінічного використання людиною. Мишачі антитіла не можна вводити неодноразово людині, оскільки імунна система визнає їх чужорідними і відповість на них нейтралізуючими антитілами. Цю проблему можна мінімізувати за допомогою генетичної інженерії антитіла в клітині миші В. Змінні області генів легкого та важкого ланцюга миші лігуються до постійних областей людини, а химерний ген потім переноситься в клітину-господаря. Це дозволяє виробляти MaB, який в основному є «людським», причому лише антиген-зв'язуючий сайт має походження миші.

    Гуманізовані MAB успішно використовуються для лікування раку з мінімальними побічними ефектами. Наприклад, гуманізований препарат моноклональних антитіл Герцептин був корисним для лікування деяких видів раку молочної залози. Також було проведено кілька попередніх випробувань гуманізованого MaB для лікування інфекційних захворювань, але жодне з цих методів лікування в даний час не використовується. У деяких випадках MAB виявилися занадто специфічними для лікування інфекційних захворювань, оскільки вони розпізнають деякі серовари збудника, але не інші. Використання коктейлю з декількох MAB, які націлені на різні штами збудника, може вирішити цю проблему. Однак великі витрати, пов'язані з виробництвом MaB, є ще однією проблемою, яка не дозволила MAB стати практичними для використання при лікуванні мікробних інфекцій. 1

    Однією з перспективних технологій для недорогих MAB є використання генно-інженерних рослин для отримання антитіл (або плантітітіл). Ця технологія перетворює рослинні клітини на фабрики антитіл, а не покладаючись на клітини культури тканин, які є дорогими та технічно вимогливими. У деяких випадках може бути навіть можливо доставити ці антитіла, змушуючи пацієнтів їсти рослини, а не шляхом вилучення та введення антитіл. Наприклад, в 2013 році дослідницька група клонувала гени антитіл на рослини, які мали здатність нейтралізувати важливий токсин від бактерій, які можуть викликати важкі захворювання шлунково-кишкового тракту. 2 Вживання рослин потенційно може доставити антитіла безпосередньо до токсину.

    Вправа\(\PageIndex{4}\)

    1. Як виробляються гуманізовані моноклональні антитіла?
    2. Що означає «моноклональний» моноклональних антитіл?

    Використання моноклональних антитіл для боротьби з Еболою

    Під час спалаху Еболи 2014—2015 років у Західній Африці кілька пацієнтів, інфікованих Еболою, лікувалися ZmAPP, препаратом, який виявився ефективним у випробуваннях, проведених у резус-макаках лише за кілька місяців до цього. 3 ZmApp - це комбінація трьох MAB, що виробляються шляхом включення генів антитіл до тютюнових рослин за допомогою вірусного вектора. Використовуючи три MAB, препарат ефективний для декількох штамів вірусу. На жаль, було достатньо ZmAPP для лікування крихітної кількості пацієнтів.

    Незважаючи на те, що нинішня технологія не є достатньою для виробництва великої кількості ZmAPP, вона показує, що рослинні тіла - MAB, що виробляються рослинами, є доцільними для клінічного використання, потенційно економічно ефективними та варті подальшого розвитку. За останні кілька років спостерігається вибух кількості нових препаратів на основі MAB для лікування раку та інфекційних захворювань; однак широке використання таких препаратів в даний час гальмується їх непомірною вартістю, особливо в слаборозвинених частинок світу, де одна доза може коштувати дорожче ніж довічний дохід пацієнта. Розробка методів клонування генів антитіл у рослини може різко скоротити витрати.

    Ключові поняття та резюме

    • Антитіла зв'язуються з високою специфічністю до антигенів, використовуваних для виклику імунній системі, але вони також можуть проявляти перехресну реактивність шляхом зв'язування з іншими антигенами, які поділяють хімічні властивості з вихідним антигеном.
    • Ін'єкція антигену тварині призведе до поліклональної відповіді антитіл, в якій виробляються різні антитіла, які реагують з різними епітопами на антиген.
    • Поліклональні антисироватки корисні для деяких видів лабораторних аналізів, але інші аналізи вимагають більшої специфічності. Діагностичні тести, які використовують поліклональні антисироватки, зазвичай використовуються лише для скринінгу через можливість хибнопозитивних та хибно-негативних результатів.
    • Моноклональні антитіла забезпечують більш високу специфічність, ніж поліклональні антисироватки, оскільки вони зв'язуються з одним епітопом і зазвичай мають високу спорідненість.
    • Моноклональні антитіла, як правило, виробляються шляхом культивування гібридом, що секретують антитіла, отриманих від мишей. MAB в даний час використовуються для лікування раку, але їх непомірна вартість перешкоджала їх більш широкому використанню для лікування інфекційних захворювань. Тим не менш, їх потенціал для лабораторного та клінічного використання є рушійною причиною розробки нових, економічно ефективних рішень, таких як плантітіла.

    Виноски

    1. 1 Сейлор, Каролін, Катерина Дадачова та Артуро Касадевалл, «Терапія на основі моноклональних антитіл для мікробних захворювань» Вакцина 27 (2009): G38-G46.
    2. 2 Наканіші, Кацухіро та ін., «Виробництво гібридних IgG/IgA плантитіл з нейтралізуючою активністю проти токсину шига 1,» PLoS One 8, № 11 (2013): e80712.
    3. 3 Цю, Сянго та співавт., «Реверсія прогресивної хвороби вірусу Ебола у нелюдських приматів із ZMapP», Природа 514 (2014): 47—53.