12.3: Методи цілого генома та промислове застосування

Цілі навчання

• Поясніть використання порівняльного аналізу в масштабах генома
• Узагальнити переваги генетично інженерних фармацевтичних продуктів

Досягнення в молекулярній біології призвели до створення абсолютно нових галузей науки. Серед них є поля, які вивчають аспекти цілих геномів, які в сукупності називаються методами цілого генома. У цьому розділі ми надамо короткий огляд цілих геномних полів геноміки, транскриптоміки та протеоміки.

Геноміка, транскриптоміка та протеоміка

Вивчення та порівняння цілих геномів, включаючи повний набір генів та їх нуклеотидну послідовність та організацію, називається геномікою. Ця галузь має великий потенціал для майбутніх медичних досягнень завдяки вивченню генома людини, а також геномів інфекційних організмів. Аналіз мікробних геномів сприяв розробці нових антибіотиків, діагностичних засобів, вакцин, медичних методів лікування та методів очищення навколишнього середовища.

Область транскриптоміки - наука про всю колекцію молекул мРНК, що виробляються клітинами. Вчені порівнюють схеми експресії генів між інфікованими та неінфікованими клітинами-господарями, отримуючи важливу інформацію про клітинні реакції на інфекційне захворювання Крім того, транскриптоміка може бути використана для моніторингу експресії генів факторів вірулентності у мікроорганізмів, допомагаючи вченим краще зрозуміти патогенні процеси з цієї точки зору.

Коли геноміка та транскриптоміка застосовуються до цілих мікробних спільнот, ми використовуємо терміни метагеноміка та метатранскриптоміка відповідно. Метагеноміка та метатранскриптоміка дозволяють дослідникам вивчати гени та експресію генів із колекції декількох видів, багато з яких можуть бути нелегко культивуються або культивуються взагалі в лабораторії. Мікромасив ДНК (розглянуто в попередньому розділі) може бути використаний в дослідженнях метагеноміки.

Іншим перспективним клінічним застосуванням геноміки та транскриптоміки є фармакогеноміка, яка також називається токсикогеномікою, яка передбачає оцінку ефективності та безпеки ліків на основі інформації з геномної послідовності індивіда. Геномні реакції на препарати можуть бути вивчені за допомогою експериментальних тварин (таких як лабораторні щури або миші) або живі клітини в лабораторії, перш ніж приступати до досліджень з людьми. Зміни в експресії генів у присутності препарату іноді можуть бути раннім показником потенційних токсичних ефектів. Особиста інформація про послідовність геному може коли-небудь бути використана для призначення ліків, які будуть найбільш ефективними та найменш токсичними на основі індивідуального генотипу пацієнта.

Вивчення протеоміки є продовженням геноміки, що дозволяє вченим вивчати весь комплемент білків в організмі, який називається протеомом. Незважаючи на те, що всі клітини багатоклітинного організму мають однаковий набір генів, клітини різних тканин виробляють різні набори білків. Таким чином, геном постійний, але протеом змінюється і динамічний всередині організму. Протеоміка може бути використана для вивчення того, які білки експресуються в різних умовах в межах одного типу клітин або для порівняння моделей експресії білка між різними організмами.

Найвідомішим захворюванням, яке вивчається за допомогою протеомних підходів, є рак, але ця область дослідження застосовується і до інфекційних захворювань. В даний час ведуться дослідження з вивчення доцільності застосування протеомних підходів для діагностики різних видів гепатиту, туберкульозу та ВІЛ-інфекції, які досить важко діагностувати за допомогою наявних в даний час методик. ¹

Недавній і розвивається протеомний аналіз спирається на виявлення білків, званих біомаркерами, на експресію яких впливає процес захворювання. Біомаркери в даний час використовуються для виявлення різних форм раку, а також інфекцій, спричинених патогенами, такими як Yersinia pestis та Vaccinia virus. ²

Інші «-омічні» науки, пов'язані з геномікою та протеомікою, включають метаболоміку, глікоміку та ліпідоміку, які зосереджуються на повному наборі дрібномолекулярних метаболітів, цукрів та ліпідів, відповідно, знайдених всередині клітини. Завдяки цим різним глобальним підходам вчені продовжують збирати, компілювати та аналізувати великі обсяги генетичної інформації. Ця нова область біоінформатики може бути використана, серед багатьох інших додатків, для підказок до лікування захворювань та розуміння роботи клітин.

Крім того, дослідники можуть використовувати зворотну генетику, методику, пов'язану з класичним мутаційним аналізом, для визначення функції конкретних генів. Класичні методи дослідження генної функції передбачають пошук генів, відповідальних за заданий фенотип. Зворотна генетика використовує протилежний підхід, починаючи з певної послідовності ДНК і намагаючись визначити, який фенотип вона виробляє. Крім того, вчені можуть приєднувати відомі гени (звані репортерними генами), які кодують легко спостережувані характеристики до генів, що представляють інтерес, і місце експресії таких генів, що цікавлять, можна легко контролювати. Це дає досліднику важливу інформацію про те, що може робити генний продукт або де він знаходиться в організмі. Загальні гени репортера включають бактеріальний LacZ, який кодує бета-галактозидазу і активність яких може контролюватися змінами кольору колонії в присутності X-Gal, як описано раніше, і ген, що кодує білок медуз зелений флуоресцентний білок (GFP), активність якого може бути візуалізована в колоніях під впливом ультрафіолету (рис.\(\PageIndex{1}\)).

Малюнок\(\PageIndex{1}\): (а) Ген, що кодує зелений флуоресцентний білок, є широко використовуваним геном репортера для моніторингу моделей експресії генів в організмах. Під ультрафіолетовим світлом GFP флуоресцентує. Тут дві миші висловлюють GFP, в той час як середня миша - ні. (b) GFP також може використовуватися як репортерний ген у бактерій. Тут показана пластина, що містить бактеріальні колонії, що експресують ГФП. (c) Синьо-білий скринінг у бактерій здійснюється шляхом використання гена LacZ репортера з подальшим нанесенням бактерій на середовище, що містить X-gal. Розщеплення X-Gal ферментом LacZ призводить до утворення синіх колоній. (кредит а: модифікація роботи Інгрід Моен, Шарлотта Джен, Цзянь Ван, Карл-Хеннінг Калланд, Марта Чекенія, Ларс А Акслен, Лінда Слейр, Пер Ø Енгер, Рольф К Рід, Енн М. Оян, Лінда ЕБ Штур; кредит б: модифікація роботи «2.5jigen.com» /Flickr; кредит c: модифікація роботи Американського товариства Мікробіологія)

Вправа\(\PageIndex{1}\)

1. Чим геноміка відрізняється від традиційної генетики?
2. Якби ви хотіли вивчити, як дві різні клітини в організмі реагують на інфекцію, яке поле —omics ви б застосували?
3. Для чого використовуються біомаркери, виявлені в протеоміці?

Клінічна спрямованість: Дозвіл

Оскільки симптоми Кайли були стійкими і досить серйозними, щоб заважати повсякденній діяльності, лікар Кайли вирішив замовити деякі лабораторні аналізи. Лікар зібрав зразки крові Кайли, спинномозкової рідини (спинномозкової рідини) та синовіальної рідини (з одного з її набряклих колін) і попросив ПЛР-аналіз на всіх трьох зразках. ПЛР-тести на лікворі та синовіальної рідини повернулися позитивними на наявність Borrelia burgdorferi, бактерії, яка викликає хворобу Лайма.

Лікар Кайла відразу ж призначив повний курс антибіотика доксициклін. На щастя, Кайла повністю одужала протягом декількох тижнів і не страждала від довгострокових симптомів синдрому хвороби Лайма (ПТЛДС) після лікування, який вражає 10— 20% пацієнтів з хворобою Лайма. Щоб запобігти майбутнім інфекціям, лікар Кайли порадив їй використовувати засіб від комах та носити захисний одяг під час її пригод на свіжому повітрі. Ці заходи можуть обмежити вплив кліщів, що несуть Лайм, які поширені в багатьох регіонах США в теплу пору року. Кайлі також порадили завести звичку обстежувати себе на наявність кліщів після повернення з активного відпочинку, так як оперативне видалення кліща значно знижує шанси на зараження.

Хвороба Лайма часто важко діагностувати. B. burgdorferi не легко культивується в лабораторії, а початкові симптоми можуть бути дуже легкими і нагадувати симптоми багатьох інших захворювань. Але якщо не лікувати, симптоми можуть стати досить важкими і виснажливими. На додаток до двох тестів на антитіла, які були безрезультатними у випадку Кайли, та ПЛР-тесту, Південний блот міг бути використаний із специфічними зондами ДНК B. burgdorferi для ідентифікації ДНК із збудника. Секвенування генів поверхневого білка видів Borrelia також використовується для ідентифікації штамів всередині виду, які можуть легше передаватися людині або викликати більш важке захворювання.

Технологія рекомбінантної ДНК та фармацевтичне виробництво

Генна інженерія забезпечила спосіб створення нових фармацевтичних продуктів, які називаються рекомбінантними ДНК-фармацевтичними препаратами. До таких продуктів відносяться антибіотичні препарати, вакцини, гормони, які використовуються для лікування різних захворювань. У таблиці\(\PageIndex{1}\) наведено приклади рекомбінантних продуктів ДНК та їх використання.

Наприклад, природні шляхи синтезу антибіотиків різних Streptomyces spp., давно відомі своїми можливостями виробництва антибіотиків, можуть бути модифіковані для підвищення врожайності або створення нових антибіотиків шляхом введення генів, що кодують додаткові ферменти. Понад 200 нових антибіотиків було вироблено завдяки цілеспрямованій інактивації генів та нової комбінації генів синтезу антибіотиків у господарів Streptomyces, що продукують антибіотики. ³

Генна інженерія також використовується для виготовлення субодиничних вакцин, які безпечніші за інші вакцини, оскільки містять лише одну антигенну молекулу і не мають будь-якої частини генома збудника (див. Вакцини). Наприклад, вакцина від гепатиту В створюється шляхом введення гена, що кодує поверхневий білок гепатиту В в дріжджі; дріжджі потім виробляють цей білок, який імунна система людини визнає антигеном. Антиген гепатиту В очищають від дріжджових культур і вводять пацієнтам у вигляді вакцини. Незважаючи на те, що вакцина не містить вірусу гепатиту В, наявність антигенного білка стимулює імунну систему виробляти антитіла, які захистять пацієнта від вірусу у разі впливу. ^{4 5}

Генна інженерія також має важливе значення у виробництві інших терапевтичних білків, таких як інсулін, інтерферони та гормон росту людини, для лікування різних захворювань людини. Наприклад, свого часу лікувати цукровий діабет можна було тільки шляхом надання пацієнтам свинячого інсуліну, який викликав алергічні реакції через невеликі відмінності між білками, вираженими в людському і свинячому інсуліні. Однак з 1978 року технологія рекомбінантної ДНК була використана для отримання великих кількостей людського інсуліну з використанням кишкової палички у відносно недорогому процесі, який дає більш послідовно ефективний фармацевтичний продукт. Вчені також генетично сконструйовані кишкової палички здатні виробляти гормон росту людини (HGH), який використовується для лікування порушень росту у дітей та деяких інших порушень у дорослих. Ген HGH був клонований з бібліотеки кДНК і вставлений в E. coli клітини шляхом клонування його в бактеріальний вектор. Зрештою, генна інженерія буде використовуватися для виробництва ДНК-вакцин та різних генних методів терапії, а також індивідуальних ліків для боротьби з раком та іншими захворюваннями.

Таблиця\(\PageIndex{1}\): Деякі генетично інженерні фармацевтичні продукти та програми

Рекомбінантний продукт ДНК	Додаток
Передсердний натрійуретичний пептид	Лікування захворювань серця (наприклад, застійної серцевої недостатності), захворювань нирок, високого кров'яного тиску
ДНКАз	Лікування в'язких виділень легенів при муковісцидозі
еритропоетин	Лікування важкої анемії з ураженням нирок
Фактор VIII	лікування гемофілії
Вакцина проти гепатиту В	Профілактика зараження гепатитом В
Гормон росту людини	Лікування дефіциту гормону росту, синдрому Тернера, опіків
Інсулін людини	лікування цукрового діабету
Інтерферони	Лікування розсіяного склерозу, різних видів раку (наприклад, меланоми), вірусних інфекцій (наприклад, гепатиту В і С)
Тетраценоміцини	Використовується як антибіотики
Тканинний активатор плазміногену	Лікування легеневої емболії при ішемічному інсульті, інфаркті

Вправа\(\PageIndex{2}\)

1. Яка бактерія була генетично сконструйована для виробництва людського інсуліну для лікування діабету?
2. Поясніть, як мікроорганізми можуть бути розроблені для виробництва вакцин.

Технологія перешкод РНК

У розділі «Структура та функція РНК» ми описали функцію мРНК, рРНК та тРНК. Крім цих типів РНК, клітини також виробляють кілька типів малих некодуючих молекул РНК, які беруть участь в регуляції експресії генів. До них відносяться антисенсові молекули РНК, які доповнюють ділянки специфічних молекул мРНК, що містяться як у прокаріотів, так і в еукаріотичних клітині. Некодуючі молекули РНК відіграють важливу роль у інтерференції РНК (РНК), природному регулювальному механізмі, за допомогою якого молекули мРНК не дозволяють керувати синтезом білків. Інтерференція РНК конкретних генів виникає внаслідок сполучення основи коротких одноланцюгових антисенсових молекул РНК до областей всередині взаємодоповнюючих молекул мРНК, запобігаючи синтезу білка. Клітини використовують інтерференцію РНК для захисту від вірусної інвазії, яка може вводити дволанцюгові молекули РНК як частину процесу реплікації вірусу (рис.\(\PageIndex{2}\)).

Малюнок\(\PageIndex{2}\): Клітини, такі як еукаріотична клітина, показана на цій діаграмі, зазвичай роблять невеликі антисенсові молекули РНК з послідовностями, що доповнюють конкретні молекули мРН Коли молекула антисенсивної РНК пов'язана з молекулою мРНК, мРНК більше не може використовуватися для безпосереднього синтезу білка. (Кредит: модифікація роботи Робінсона Р)

В даний час дослідники розробляють методи імітації природного процесу втручання РНК як способу лікування вірусних інфекцій в еукаріотичних клітині. Технологія інтерференції РНК передбачає використання малих інтерференційних РНК (siRNA) або мікроРНК (miRNA) (рис.\(\PageIndex{3}\)). SiRNA повністю доповнюють стенограму мРНК конкретного гена, що представляє інтерес, тоді як miRNA в основному взаємодоповнюють. Ці дволанцюгові РНК пов'язані з DICER, ендонуклеазою, яка розщеплює РНК на короткі молекули (приблизно 20 нуклеотидів довжиною). Потім РНК зв'язуються з РНК-індукованим комплексом глушіння (RISC), рибонуклеопротеїном. Комплекс SiRNA-RISC зв'язується з мРНК і розщеплює її. Для miRNA тільки одна з двох ниток зв'язується з RISC. Потім комплекс miRNA-RISC зв'язується з мРНК, пригнічуючи трансляцію. Якщо міРНК повністю доповнює ген-мішень, то мРНК може бути розщеплена. Разом ці механізми відомі як глушіння генів.

Малюнок\(\PageIndex{3}\): Ця діаграма ілюструє процес використання SiRNA або miRNA в еукаріотичній клітині для заглушення генів, що беруть участь у патогенезі різних захворювань. (кредит: модифікація роботи Національного центру біотехнологічної інформації)

Ключові поняття та резюме

• Наука про геноміку дозволяє дослідникам вивчати організми на цілісному рівні і має безліч застосувань, що мають медичне значення.
• Транскриптоміка та протеоміка дозволяють дослідникам порівнювати моделі експресії генів між різними клітинами і демонструють великі перспективи в кращому розумінні глобальних реакцій на різні умови.
• Різні технології оміки доповнюють один одного і разом дають більш повне уявлення про стан організму або мікробної спільноти (метагеноміки).
• Аналіз, необхідний для великих наборів даних, отриманих за допомогою геноміки, транскриптоміки та протеоміки, призвів до появи біоінформатики.
• Репортерні гени, що кодують легко спостережувані характеристики, зазвичай використовуються для відстеження зразків експресії генів генів невідомої функції.
• Використання технології рекомбінантної ДНК зробило революцію у фармацевтичній промисловості, що дозволило швидко виробляти високоякісні рекомбінантні ДНК-фармацевтичні препарати, що використовуються для лікування найрізноманітніших захворювань людини.
• Технологія інтерференції РНК має великі перспективи як метод лікування вірусних інфекцій шляхом придушення експресії конкретних генів.

Виноски

1. 1 Е.О., Д.Е. Берріман, Б. бауер, Л.Сакманн-Сала, Е. Госні, Дж. Дінг, С.Окада, і Дж. «Використання протеоміки для вивчення інфекційних захворювань». Інфекційні розлади-цілі для наркотиків (раніше поточні ліки - інфекційні розлади) 8 № 1 (2008): 31—45.
2. 2 Мохан Натесан і Роберт Г. Ульріх. «Білкові мікромасиви та біомаркери інфекційних хвороб». Міжнародний журнал молекулярних наук 11 № 12 (2010): 5165—5183.
3. 3 Хосе-Луїс Адріо та Арнольд Л. Демен. «Рекомбінантні організми для виробництва промислової продукції». Біоінженерні помилки 1 № 2 (2010): 116—131.
4. 4 Міністерство охорони здоров'я та соціальних служб США. «Види вакцин». 2013 р. www.vaccines.gov/more_info/types/ #subunit. Доступ до 27 травня 2016 р.
5. 5 Список наркотиків в Інтернеті. Рекомбівакс. 2015 рік. http://www.rxlist.com/recombivax-drug.htm. Доступ до 27 травня 2016 р.